一种提高α-葡萄糖基化丁香酚产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及利用大孔吸附树脂固定丁香酚，通过野油菜黄单胞菌(ZafliAofflmas campestri5)CGMCC N0.1243发酵液催化固定化的丁香酸和游离的麦芽糖制备α-葡萄糖基化丁香酚的方法。
【背景技术】
[0002]此丁香酚具有抑菌、麻醉、解热、抗氧化、抗肿瘤、促进透皮吸收、驱蚊等多种药理活性。但在实际应用中往往有不溶于水，不稳定，置露空气下变黑稠黏，有刺激臭等不良性质的限制。因此，在保留其活性前提下，对其进行结构改造，从而改变不良物理性质，扩大其应用范围。
[0003]近几年的研宄表明，通过葡萄糖基化靶向性的改造酚类化合物，不但可以改变其不良的物理性质，例如难溶于水，有酸苦味和刺激性气味等，更能提高其生物活性和使用安全性，从而扩大酚类物质的使用范围。
[0004]然而作为反应底物的丁香酚具有抑菌作用，丁香酚通过作用细胞膜，使细菌溶解死亡。因而在反应体系中只能加入少量的丁香酚，因此，研宄一种可以大量的加入丁香酚又不会造成抑菌的方法，是大规模生产α -葡萄糖基化丁香酚的前提条件。
[0005]大孔吸附树脂具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，已在环保、食品、医药等领域得到广泛应用。在此将其作为固定化丁香酚的载体，在反应中起到两个重要作用:一、减少丁香酚的杀菌作用。二、提高反应液中丁香酚的添加量。
[0006]日本学者Toshiyuki Sato通过野油菜黄单胞菌WU-9701的粗酶液成功糖基化改造了多种物质，例如咖啡酸、薄荷醇、儿茶素、对苯二酚等等，并首次使用丁香酚和麦芽糖转化制得了 α-葡萄糖基化丁香酚。但此方法提取酶过程较繁琐，且反应体系小，实际生产规模中很难采用此法。
[0007]国内张鹏、陈畅、汪盈、苑丽辉等也通过生物转化法制得α -葡萄糖基化丁香酚。分别采用野油菜黄单胞菌(campes tri5)CGMCC N0.1243的菌体发酵液和提取了黄单胞菌中的酶来参与糖基化反应。但这两种方法均存在以下问题:
一、菌体或酶对丁香酚的耐受程度不高，导致产量不高；
二、丁香酚易挥发，在反应过程中浓度越来越小；
三、α-葡萄糖基化丁香酚的转化率不高，尤其是麦芽糖的利用率极低；
四、丁香酚的加入方式容易导致菌体直接致死而转化失败。
[0008]为了解决上述问题，减少底物(丁香酚)抑制是最好的解决办法。通过用树脂将丁香酚固定的方式，使其在发酵液中游离的浓度降低至基本为零，从而减少丁香酚的挥发，而菌体的生长代谢不受影响，可以更好的催化合成α -葡萄糖基化丁香酚；由于消除了底物抑制，可以提高单位体积发酵液中的丁香酚的浓度；此外发酵液中几乎不存在游离丁香酚，可以减少起保护作用的麦芽糖添加量；最后反应结束后，产物与反应物均在树脂上，简化了后续产物分离纯化工艺。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是克服现有技术的一些缺陷，利用树脂固定丁香酚，从而减少丁香酚的抑菌作用，提高单位体积发酵液内的丁香酚浓度，进而提高α-葡萄糖基丁香酚的产量。用野油菜黄单胞菌(ZafliAofflmas campes tri5)CGMCC N0.1243发酵液催化固定化的丁香酚，在最佳反应条件下催化合成α-葡萄糖基化丁香酚。该方法消除了丁香酚在游离发酵液中的抑菌作用，大大减少了麦芽糖的添加量，简化了产物后续分离纯化的工艺，大大降低了操作导致的转化失败的风险，具有产量高、成本低、工艺简单、操作安全等优势，为大规模生产α-葡萄糖基化丁香酚奠定了基础。
[0010]本发明的整体技术构思是:
利用树脂固定丁香酸作为野油菜黄单胞菌campes tri s) CGMCC N0.1243催化合成α-葡萄糖基化丁香酚的反应物，该方法由下列工艺步骤组成:
(1)树脂固定化丁香酚的制备；
(2)野油菜黄单胞菌(ZafliAofflmascampes tri s) CGMCC N0.1243斜面种子的制备和液体发酵；
(3)加入麦芽糖和树脂固定的丁香酚进行反应；
(4)α -葡萄糖基化丁香酚的分离纯化本发明的具体工艺步骤及工艺条件是:
步骤(I)中固定化丁香酸的制备:
先将丁香酚溶于95%浓度的乙醇，再制得质量百分比浓度为2-15%的丁香酚水溶液，然后在每10ml 丁香酚水溶液中加入1g树脂进行吸附；吸附结束后用10%浓度酒精冲洗树脂表面丁香酚，再用去离子水冲洗，制得吸附量为0.1-0.Sg 丁香酚/g树脂的固定化丁香酚。
[0011]步骤(2)中的培养基由下列重量份组分组成:
蔗糖10-50份，蛋白胨2-12份，酵母粉1-6份，氯化钠1-2份，碳酸氢钠1_2份，三水合磷酸氢二钾1-2份，七水合硫酸镁1-2份，水1000份和琼脂10-20份(固体加，液体不加)。
[0012]制备斜面种子的工艺条件为，先制备斜面培养基，再挑取单菌落在斜面培养基上画斜线，在温度为15-35°C，培养15-45小时。
[0013]挑取一定量斜面种子，加入到50ml的液体培养基中，在温度为25_35°C，转速为100-200转/分钟的摇床中培养12-36小时，得到具有较强催化力的发酵液。
[0014]步骤(3)中反应条件为:
在50ml发酵液中加入固定了丁香酚的树脂和麦芽糖，其中树脂的浓度为1-1OOg树脂/L发酵液，麦芽糖的物质的量浓度为200-1000mmol/L ;在反应温度为25_45°C，转速为150-250转/分钟的条件下反应48-96小时。
[0015]步骤(4)中α -葡萄糖基化丁香酚的分离纯化步骤如下:
a)将发酵液过滤得到树脂，用去离子水将树脂表面发酵液冲洗干净；
b)把洗涤后的树脂用体积浓度为10-80%的酒精进行洗脱，同时收集洗脱液；
c)将b中的洗脱液进行旋转蒸发，旋转蒸发的温度为50-70°C，真空度为0.1MP,浓缩时间为2-6小时，在浓度到产品到饱和状态时，放入温度为0-4°C进行结晶，结晶经干燥后可得到纯度在98%以上的α -葡萄糖基化丁香酚产品。
[0016]本发明所用的野油菜黄单胞菌(ZafliAofflmas campes tri5)CGMCC N0.1243已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研宄所(100080)，保藏号为野油菜黄单胞菌CGMCC N0.1243，保藏时间为2004年11月8日。
[0017]本发明所取得的技术进步在于:
本发明通过以固定化丁香酸作为野油菜黄单胞菌i Xanthomonas campes tri s') CGMCCN0.1243催化合成α-葡萄糖基化丁香酚的反应底物，解决了丁香酚在游离发酵液中因抑菌作用导致转化生成α -葡萄糖基化丁香酚的产量低，产物分离工艺复杂，人为操作易导致转化失败等问题。利用本发明生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法具有以下优点:
(I)解决了丁香酚难溶于水的问题，提高单位体积发酵液丁香酚的浓度，进而提高了α -葡萄糖基化丁香酚的产量，降低了生产成本。
[0018](2)消除了丁香酚在游离发酵液中的抑菌作用，进而减少起底物保护作用的麦芽糖添加量，进一步减少成本；同时避免人为操作容易导致的菌体大量死亡而转化失败的现象。
[0019](3)反应是在树脂表面进行，反应结束后产物直接固定在树脂上，只需要简单的过滤即可把产物与发酵液分离出来，大大简化了产物后续分离纯化工艺。
[0020](4)在反应结束后，丁香酚依然固定在树脂上，菌体未遭到破坏，可以继续转化使用，减少了培养周期，培养原料，更进一步提高生产效率。
[0021]采用本发明生产α-葡萄糖基化丁香酚产量高，每升发酵液产α-葡萄糖基化丁香酚量为30-50g，对丁香酚的转化率均达到90.5-94%，分离纯化后，产品纯度可达98%以上，具有工业化意义。
[0022]实施例:以下结合实施例对本发明作进一步描述。
[0023]实施例1
(I)树脂固定化丁香酚的制备:
先将丁香酚溶于95%乙醇中，然后制得质量百分比浓度为15%的丁香酚水溶液；在每10ml 丁香酚水溶液中加入1g非极性树脂HZ801，SP207，SP850，H103，H107 ;吸附后的树脂用10%乙醇冲洗表面丁香酚，再用去离子水洗净表面，制得吸附量0.Sg 丁香酚/g树脂的固定化丁香酚。
[0024](2)野油菜黄单胞菌斜面制备及液体发酵其中菌种培养基由下列重量份组分组成:
蔗糖40份，蛋白胨8份，酵母粉3份，氯化钠I份，碳酸氢钠I份，三水合磷酸氢二钾2份，七水合硫酸镁I份，水1000份和琼脂20份(固体加，液体不加)。
[0025]制备斜面种子的工艺条件为，先制备斜面培养基，再挑取单菌落在斜面上画斜线，在温度为15°C，培养30小时。
[0026]挑取一定量斜面种子，加入到50ml的液体培养基中，在温度为25°C，转速为200转/分钟的摇床中培养