062] 除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的 普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYAND MOLE⑶LARBIOLOGY(《微生物学和分子生物学词典》），第三版，纽约约翰威立国际出版公司 (JohnWileyandSons,Ltd.，NewYork) (2007);以及Hale和Marham，THEHARPERCOLLINS DICTIONARYOFBI0L0GY(《哈珀柯林斯生物学词典》），纽约哈珀永久出版社（Harper Perennial，NY) (1991)为技术人员提供了许多本发明所用术语的通用词典。虽然任何与本 文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于实施或测试本发明，但描述的 是优选的方法和材料。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指示，否则分别是核酸以 5'至3'的取向从左向右书写，而氨基酸序列以氨基至羧基取向从左向右书写。对于本领域 的定义和术语，从业者尤其被引导向Green和Sambrook，MolecularCloning:ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册）（第四版），ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷 泉港实验室出版社）2012和AusubelFM等，1993。应当理解，本发明并不限于所述的具体 方法、规程和试剂，它们可以有所不同。
[0063] 本文提供的标题并不排除本发明的其他各个方面或实施例，这些方面或实施例都 可以借助对说明书做整体参考而获得。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一 个整体来参考会得到更完全的定义。
[0064] 本文引述的所有出版物明确地以引用的方式并入本文，用以描述和公开可结合本 发明使用的组合物和方法。
[0065]I.宙义
[0066] 术语"氨基酸序列"与术语"多肽"、"蛋白质"和"肽"是同义词，并且可互换使用。 当这些氨基酸序列展现活性时，其可称为"酶"。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代 码，其中氨基酸序列是以标准的氨基至羧基末端取向（即N-C)呈现。
[0067] 术语"核酸"涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单 链或双链的，并且可以具有化学修饰。术语"核酸"与"多核苷酸"可互换使用。由于遗传 密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方 法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。因此，本发明设想了编码CBH或其变体的每种 可能的变体核苷酸序列，考虑到遗传密码的简并性，所有这些变体核苷酸序列都是可能的。 除非另作指示，否则核酸序列以5'至3'取向呈现。
[0068] "纤维素酶（cellulase或cellulaseenzyme) "意指细菌或真菌外切葡聚糖酶或 外切纤维二糖水解酶和/或内切葡聚糖酶和/或葡萄糖苷酶。已知这三种不同类型的 纤维素酶协同作用，将纤维素及其衍生物转化成葡萄糖。
[0069] 如本文中所用的"纤维二糖水解酶"或"CBH"或"CBH酶"或"CBH多肽"被 定义为1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶（E.C. 3. 2. 1.91)，其催化纤维素、纤维四糖 ((^11的扣1^〇此）或任何含有0-1，4-连接葡萄糖的聚合物中1，4-0-〇-糖苷键的水 解，从而从链的非还原性末端释放出纤维二糖。根据以下文献所述的程序出于本发明的 目的测定纤维二糖水解酶（CBH)活性：Lever等人，1972,Anal.Biochem.(《分析生物化 学》）47:273-279和其变化形式（参见下文的实例部分），和/或vanTilbeurgh等人， 1982,FEBSLetters(《欧洲生物化学协会联合会快报》），149:152-156。
[0070] 如本文所述的酶、蛋白质、多肽、核酸或多核苷酸的"变体"意指变体是来自亲本多 肽或亲本核酸（例如原生、野生型或其他限定的亲本多肽或核酸），与亲本相比包括至少一 个修饰或改变。改变/修饰可包括亲本中一个或多个位点处的氨基酸/核酸残基置换成不 同的氨基酸/核酸残基、亲本中一个或多个位点处的氨基酸/核酸残基（或一系列氨基酸/ 核酸残基）缺失、亲本中一个或多个位点处的氨基酸/核酸残基（或一系列氨基酸/核酸 残基）插入、氨基和/或羧基末端氨基酸序列或5'或3'核酸序列截短，以及其组合。根据 本发明方面的变体CBH酶（有时称为"CBH变体"）保留纤维素酶活性，但在一些具体方面 可具有改变的特性，例如改进的特性。例如，变体CBH酶可具有改变的pH最适性、改进的热 稳定性或氧化稳定性或其组合，但将保留其特征性纤维素酶活性。
[0071] "组合变体"是包含两个或更多个突变，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等置换、缺失 和/或插入的变体。
[0072] 如本文所用的"亲本CBH1酶"或"亲本CBH酶"或"亲本CBH多肽"或其对等词意 指成熟形式包含以下氨基酸序列的多肽：与SEQIDN0:3具有至少80%同一性的氨基酸 序列，包括与SEQIDN0:3 具有至少 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列， SEQIDN0:3提供来自红褐肉座菌的成熟形式的野生型CBH1的氨基酸序列。应注意词语 "亲本"和"亲本的"在此语境中可互换使用。在某些方面，亲本CBH酶包含SEQIDN0:2至 8中任一者或其等位基因变体的氨基酸序列，或其具有纤维素酶活性的片段。在某些实施例 中，亲本CBH酶是来自真菌和卵菌亚门的丝状真菌。丝状真菌的特征在于营养菌丝体的细 胞壁由甲壳素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂的多糖组成，通过菌丝伸长和专性好 氧的碳代谢来进行营养生长。丝状真菌亲本细胞可为但不限于以下物种的细胞：木霉属，例 如长枝木霉、绿色木霉、康宁木霉、哈次木霉；青霉属；腐质霉属，包括特异腐质霉和灰腐质 霉；金抱子囷属，包括鲁克文金抱子囷；毁丝囷属、粘帝霉属、曲霉囷属、镜抱属、脉胞囷属、 肉座菌属例如红褐肉座菌和翘孢霉属。如本文所用，术语"木霉属"（Trich〇derma)或"木 霉菌"（Trichodermasp)是指先前已分类为木霉属或目前分类为木霉属的任何真菌菌株。
[0073] 术语"野生型"是指天然存在的多肽或核酸序列，即不包含人为变异的多肽或核酸 序列。
[0074] 术语"异源"在关于核酸的部分使用时指示核酸包含在自然界中通常不会被发现 彼此成相同关系的两个或更多个子序列。例如，核酸典型地重组产生，具有两个或更多个例 如来自不相关基因的序列，所述序列经排列制成了新的功能性核酸，例如启动子来自一个 源并且编码区来自另一个源。类似地，异源多肽通常将是指在自然界中通常不会被发现彼 此成相同关系的两个或更多个子序列（例如融合多肽）。
[0075] 当关于例如细胞或核酸、多肽或载体使用时，术语"重组"指示细胞、核酸、多肽或 载体已通过引入异源核酸或多肽或改变原生核酸或多肽来进行修饰，或细胞来自如此修饰 的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然（非重组）形式的该细胞内未发现的基因，或者 表达原本会异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
[0076] 如本文所用，术语"分离的"或"纯化的"是指从其天然产生的环境中移出的核酸 或多核苷酸。一般来讲，在分离的或纯化的核酸或多肽样品中，与关注的一种或多种核酸或 一种或多种多肽天然产生的环境相比，其是以增大的绝对或相对浓度存在。
[0077] 在描述组合物中的组分或材料（例如多肽或多核苷酸）时，术语"富集"意指与产 生所富集组合物的起始组合物相比，所述组分或材料在所述组合物中是以相对增大的浓度 存在。例如，富集的CBH组合物（或样品）是其中与来自宿主生物体的初始发酵产物相比， CBH的相对或绝对浓度增大的CBH组合物（或样品）。
[0078] 如本文所用，术语"启动子"是指起到引导下游基因转录的作用的核酸序列。启 动子一般将适于靶基因在其中被表达的宿主细胞。启动子连同其他转录和翻译调控核酸 序列（也称为"控制序列"）对于表达给定基因是必要的。一般来讲，转录和翻译调控核酸 序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序 列以及增强子或激活序列。"组成型"启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动 子。"诱导型"启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。可用于本发明的诱导型启 动子的例子为里氏木霉（红褐肉座菌）cbhl启动子，其以寄存编号D86235寄存在GenBank 中。在另一方面，启动子为来自红褐肉座菌的cbhII或木糖聚酶启动子。合适启动子的例 子包括来自以下基因的启动子：泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因（Nunberg，J.H.等人。 (1984)Mol.Cell.Biol.(《分子细胞生物学杂志》）4, 2306-2315 ;Boel，E.等人。（1984) EMBOJ.(《欧洲分子生物学学会杂志》）3，1581-1585)、米赫毛霉（Mucormiehei)羧基蛋 白酶基因、红褐肉座菌纤维二糖水解酶I基因（Shoemaker，S.P.等人。（1984)欧洲专利申 请NO.EP00137280A1)、构巢曲霉trpC基因（Yelton，M.等人。（lgsCProc.Natl.Acad.Sci-USA(《美国国家科学院院刊》 )81， 1470-1474 ;Mullaney，E.J. 等人。 （1985)Mol.Gen.Genet. (《分子与一般遗传学》）199, 37-45)、构巢曲霉alcA基因（Lockington，R.A.等人。（1986) 661^(《基因》)33，137-149)、构巢曲霉七口1六基因〇^1(111§1^，6丄.等人。（1986)〇611(《细 胞》)46，143-147)、构巢曲霉amdS基因（Hynes，M.J.等人。（1983)Mol.CellBiol.(《分子 细胞生物学杂志》）3, 1430-1439)、红褐肉座菌xlnl