包含至少一种烃基(硫代)糖苷的微生物检测介质的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及通过生化手段、且更特别地通过酶促手段的微生物分析。更特别地，本 发明涉及通过接种反应介质检测微生物（例如细菌菌株），特别地用于表征（鉴定所述微生 物、测定后者对至少一种抗微生物剂的潜在的抗性性质等）和/或枚举所述微生物的目的。 这些反应介质包括生色底物和/或荧光底物，所述生色底物和/或荧光底物能够与对寻求 的微生物是特异性的微生物酶反应。 现有技术
[0002] 在本发明的框架内，无论在医疗环境还是工业环境中，最特别感兴趣的是：检 测病原微生物或质量指标（特别地用于表征和/或枚举其的目的）；并且更特别地检测 具有酯酶（特别地包括羧酸酯酶、脂肪酶和磷脂酶活性）、糖苷酶（osidase)、肽酶、硫 酸酯酶或磷酸酯酶类型的酶活性的微生物，例如沙门氏菌（Salmonella)属、埃希氏杆 菌（Escherichia)属、假单胞菌（Pseudomonas)属、李斯特菌（Listeria)属、葡萄球菌 (Staphylococcus)属、肠球菌（Enterococcus)属、假丝酵母（Candida)属的细菌或酵母； 并且更特别地，基于示出酯酶活性的存在/检测酯酶活性来检测沙门氏菌属的细菌。
[0003]大肠杆菌（Escherichiacoli)菌株经常通过示出糖苷酶类型的酶活性（比如 0-葡萄糖醛酸酶或半乳糖苷酶活性）的存在被揭示。
[0004] 以相同的方式，李斯特菌属通过示出葡萄糖苷酶活性的存在被检测。
[0005] 氨肽酶活性也可以被用于揭示微生物的群、属或种。例如，L-丙氨酸氨肽酶活性 使得区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌成为可能。
[0006] 沙门氏菌属是人类多种严重感染（伤寒热、食物中毒）的原因，其具备能够水解合 成的生色底物例如靛原底物的非特异性酯酶。
[0007] 沙门氏菌-且更通常地酯酶活性细菌-通常在培养肉汤中或在琼脂介质上被检测 并且被表征，这使得酯酶活性细菌、特别地沙门氏菌的可疑菌落的检测和表征成为可能。此 种介质的接种通过使生物学样品与介质接触来进行。
[0008] 具有酯酶、糖苷酶、肽酶、硫酸酯酶或甚至磷酸酯酶活性的细菌在它们的酶资产 (enzymeasset)上具备醋酶、糖苷酶、肽酶、硫酸醋酶或磷酸醋酶，这些酶将存在于介质中 的合成酶底物的靶标键裂解，并且因此释放所述底物的活化的发色团或荧光团部分。这导 致揭示水解、并且因此揭示靶标细菌或靶标细菌的菌落的存在的显色或荧光。
[0009] 为了能够进行大规模的例行测试，有必要的是，检测和/或表征和/或枚举介质是 稳定的并且通过限制操作实例使得可以在最大可能的程度上简化相应的检测和/或表征 和/或枚举方法。此外，重要的是，方法提供非常良好的灵敏度（显色或荧光的强度）以及 第一流的检测特异性（以便限制或甚至避免"假阳性"的检测）。可疑菌落的揭示率还是用 于检测呈现上述酶活性的细菌的这些类型的介质以及方法的基本参数。
[0010] 已知的是，酶比如酯酶、糖苷酶、肽酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶的合成底物造成与用 于微生物且特别地用于具备这些活性的细菌的培养介质之间的相容性问题。此外，随着时 间推移此种底物是不稳定的，这导致随着储存时间增加，关注的酶活性的灵敏度减少。
[0011]关于这点，标题为"SynthSsedesubstratsindigog6niques.MiseenEvidence de1'activiteesterasiquedessalmonelles'，[Synthesisofindigogenicsubstrates. Showingthepresenceoftheesteraseactivityofsalmonellae]的科学论文： A.Agban等人，Eur.J.Med.Chem. (1990) 25, 697-699,公布了包含靛原底物即特别地 溴-5-吲哚酚壬酸酯（C9)以及胆汁盐即脱氧胆酸钠的琼脂培养介质。此种培养介质经受 与在下文中参考文献FR-A-2697028阐明的那些相同的缺点。
[0012] 专利申请FR-A-2697028公开用于示出沙门氏菌的存在的培养介质，所述培养介 质包含由辛酸与吲哚残基的酯（5-溴-4-氯-3-吲哚基-辛酸酯）构成的生色酯酶底物、 以及选自胆汁盐（脱氧胆酸钠）的清洁剂。此生色和此胆汁盐被包含于允许沙门氏菌生 长的营养介质中。根据专利申请FR-A-2697028的教导，直接将胆汁盐添加至其中已经包 含酯酶底物的选择性介质。然而，此种培养介质不提供在酯酶底物的稳定性方面的所有合 意的保证。此外，证明的是此后者与培养介质不是完全混溶的。这显然损害了获得的关 于灵敏度（获得的显色的强度）、快速性和稳定性的结果的质量。还应当注意的是，根据 FR-A-2697028的培养介质采取粉末的形式。这迫使使用者进行在先操作以重构液体或胶凝 介质。这种限制由利用的酯酶底物的无稳定性造成。
[0013] 与胆汁盐-比如脱氧胆酸钠_的使用有关的另一个缺点-基于以下事实：后者是 动物来源的原材料，在质量方面的可变性程度起源于所述动物来源。
[0014] 此外，用根据FR-A-2697028的培养介质获得的结果在生物学活性方面是可完成 的。
[0015] 以该申请人的名义的专利EP-B-1334206,描述用于检测/鉴定具有选自酯酶和/ 或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的酶活性的微生物（以及特别地 细菌和/或酵母）的介质。准备好使用且储存稳定的以液体或琼脂形式的此种介质特别地 包含：
[0016]-酯酶、糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶中的至少一种底物，其 是生色的或荧光的，以及
[0017]-至少一种脱水山梨糖醇脂肪酸酯（SFAE)或至少一种脂肪酸（FA)或SFAE/FA混 合物，作为乳化稳定剂（以某种重量百分比），
[0018]-以及任选地至少一种溶剂（S)。
[0019] 还根据EP-B-1334206,优选地从包括以下的组中选择SFAE:
[0020] -聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，包含20个环氧乙烷（E.O.)单元， -TWEEN?20-;
[0021]-聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯（20E. 0.)，-TWEEN?40-;
[0022]-聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯（20E. 0.),-TVVEEN?60-;
[0023] -聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬酯酸酯（20E. 0.),-TWEEN?65-;
[0024]-聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯（20E. 0.)，-TWEEN?80-;
[0025]-聚氧乙烯脱水山梨糖醇倍半油酸酯（20E.0.),-TWEEN?83-;
[0026]-聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯（20E. 0.)，-TWEEN?85-;
[0027] 以及其混合物。
[0028] 脱水山梨糖醇脂肪酸酯（SFAE)是在食品和药物制备中广泛使用的已知的表面活 性剂。通过例证的方式，我们可以提及由DICKINSON等人的论文："J Colloid interface Sci1999年4月15日；212(2) :466-473"，其涉及包含酪蛋白酸钠以及包含20个环氧乙烷 .(TWEEN?20)?单元的聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯的乳液的稳定化。考虑的乳液是 水包油乳液（在PH6. 8下的30%体积的正十四烷）。
[0029] 虽然根据EP-B-1334206的反应介质的检测灵敏度是相对满意的，但存在对开发 微生物检测介质的需求，所述微生物检测介质基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和 /或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，并且基于比通过利用 现有技术的介质获得的那些且特别地专利EP-B-1334206的那些优越的性能。优越的性能 可以被采用以意指提高的检测灵敏度，即用于靶标微生物的菌落的最高可能的显色和/或 荧光强度。关于通过示出酯酶活性的存在检测沙门氏菌，这证明是特别地合意的。此外，且 除了必备的灵敏度标准以外，还重要的是，上述微生物检测介质是可靠的、特异性的以及可 再生的。
[0030] 本发明的一个目标是开发微生物检测介质（特别地用于表征和/或枚举其的目 的），所述微生物检测介质基于示出选自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫 酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，所述微生物检测介质包括选自酯酶底 物和/或糖苷酶底物和/或肽酶底物和/或硫酸酯酶底物和/或磷酸酯酶底物的至少一种 酶底物，所述至少一种酶底物是生色的和/或荧光的且所述至少一种酶底物是储存稳定的 (揭示的显色或荧光强度被保持在最大水平持续若干周）。
[0031] 本发明的另一个目标是获得微生物检测介质，所述微生物检测介质基于示出选自 微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活 性的存在，所述微生物检测介质不采取待被液体再生以重构液体或胶凝介质的干燥粉末的 形式，而是直接地采取准备好使用的形式。
[0032] 本发明的另一个目标旨在减少使用的生色和/或荧光酶底物（本领域技术人员已 知其是特别昂贵的）的量。
[0033] 本发明的又另一个目标在于开发获得上述检测介质的方法，所述方法易于利用， 且所述方法特别地使得可以表征寻求的微生物（特别地经由它们的鉴定和/或它们对至少 一种抗微生物剂的潜在的抗性性质的测定）和/或枚举它们而没有过多的困难。
[0034] 在阅读本申请后，其他目标将变得明显。
[0035] 发明陈述
[0036] 本发明旨在满足上述需求，且实现上文提到的目标中的全部或某些。
[0037] 因此，本发明的第一目标涉及微生物检测介质，所述检测基于示出选自微生物的 酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在， 优选地所述微生物酶活性是酯酶活性，所述介质包含：
[0038] _至少一种生色底物和/或荧光底物，其对寻求的酶活性是特异性的，优选地对酯 酶活性是特异性的；
[0039] _至少一种烃基（硫代）糖苷；
[0040]