低丙烯酰胺食品的制作方法
【专利说明】低丙烯酰胺食品
[0001] 本申请为申请号为200680043287. X的分案申请，要求2005年9月20日的优先权。
[0002] 优先权申请的交叉参考
[0003] 本非临时美国专利申请要求享有2005年9月20日提交的美国临时申请系列号 60/718, 335和2006年7月28日提交的美国临时申请系列号60/833, 788的优先权，二者的 内容在这里引作参考。 发明领域
[0004] 本发明涉及在植物中，例如在这些植物的富含淀粉的贮藏器官中下调和上调基因 的遗传方法，以降低在这些器官的加工相关的加热后积累的丙烯酰胺的水平。
[0005] 发明背景
[0006] 加热含有游离天冬酰胺和还原糖的食品，会导致丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺是在 世界范围内用于合成聚丙烯酰胺的工业化学物质。暴露于该反应性化合物，会导致在组织 中的快速吸收和均匀分布（Barber等人，Neurotoxicology 2001,22,341-353)。在啮齿动 物中，高浓度丙烯酰胺（>2mg/kg体重）的毒理学作用包括神经系统症状、生殖力减弱和癌 症（Friedman, J. Agric. Food Chem.，2003, 51，4504-4526) 〇
[0007] 还已知职业性暴露于高水平的丙烯酰胺会升高人类的神经毒性的发病率（Lo Pachin, Neurotoxicology, 2004, 25, 617-630)，但是没有记载丙稀酰胺对人类生殖的影 响或致癌作用。丙烯酰胺和它的氧化代谢物环氧丙酰胺会与血红蛋白的氨基端缬氨酸 反应，形成加合物。加合物形成的程度是暴露水平的良好标志物，且暗示着接近100 μ g 的日摄入量（Tareke 等人，J. Agric. Food Chem. ,2002, 50, 4998-5006)。尽管最初认为 饮用水、化妆品和吸烟代表着丙稀酰胺背景暴露的唯一主要来源（Bergmark, Chem. Res. Toxicol.，1997, 10, 78-84)，最近的分析表明，油炸的和烘烤的淀粉食品的消耗，构成约 36 % 的丙稀酰胺摄入（Becker 和 Pearson, Dietary habits and nutrient intake in Swedenl997-98〇 Riksmaten 1997-98, 1999)〇
[0008] 饮食丙烯酰胺主要源自热诱导的游离氨基酸天冬酰胺的氨基和还原 糖的羰基之间的反应（Mottram 等人，Nature, 2002, 419, 448-449 ;Stadler 等 人，Nature, 2002, 419, 449-450)。新鲜的马铃薯块茎含有非常高水平的天冬酰胺，但是相对 低浓度的还原糖葡萄糖和果糖。但是，在冷藏期间，通过表达冷诱导的转化酶（该酶催化蔗 糖向葡萄糖和果糖的转化），积累还原糖。
[0009] 以前尝试限制丙烯酰胺在淀粉食品中的积累，没有产生实用的且节省成本的应 用。现有技术的第一种方法是基于调整加工参数，例如表面/体积比，温度和油炸时间。尽 管这些方法的应用可能在减少丙烯酰胺的积累方面是部分有效的，但它会通过减轻颜色、 改变形状和改变口味和质地，改变最终食品的感观特征。这些改变是不希望的。
[0010] 第二种方法是基于，在加热前用天冬酰胺酶（EC 3. 5. I. 1)或glurninase(EC 3. 4. 1. 2)温育部分加工的食品（参见世界专利申请2004/030468 A3和世界专利申请 2004/026042 Al)。该方法是昂贵的，仅能容易地应用于可以与所述酶容易地混合的材料， 例如面粉。 toon] 第三种方法将天冬酰胺竞争剂例如甘氨酸加入部分加工的食品中（关于马铃薯 块茎的世界专利申请2005/025330 Al,关于烤制咖啡豆的美国专利申请2004/0081724 A1，关于可可豆的世界专利申请2005/004620 A1，关于基于玉米的食品的世界专利申请 2005/004628A1)。该方法仅是部分有效的，需要高浓度的添加剂，且因为成本太高而难以广 泛应用。
[0012] 第四种方法在加热前将还原糖改变酶（包括醛糖还原酶）加入食品中（参见美国 专利6989167)。该方法不是非常有效，且因为成本太高而难以广泛应用。
[0013] 第五种方法在加热前给食品包被选自下述的试剂：含有氨基酸的化合物，氨基酸 盐，氨基酸酰胺，氨基酸酯，和其混合物（参见世界专利申请2005/077203A3)。该方法仅 是部分有效的，且因为成本太高而难以广泛应用。
[0014] 第六种方法是基于，选择含有非常低水平的还原糖和天冬酰胺的种质。这样的种 质的可用性，使得将"低糖"和"低天冬酰胺"性状渐渗到食品工业可广泛使用的品种中成 为可能。但是，尚未鉴定出低天冬酰胺作物植物。即使将来发现了这样的种质，将希望的性 状渐渗到商业化品种中也需要至少15-20年。
[0015] 第七种方法遗传地修饰作物，以降低还原糖水平。该方法是基于下调参与淀粉降 解的基因，例如马铃薯淀粉相关的Rl和磷酸化酶-L基因的表达（参见，例如，美国专利申 请2003/0221213 Al)。尽管是部分有效的，从修饰的作物加工的食品仍然含有对照产品的 约三分之一的丙烯酰胺水平。
[0016] 因而，非常需要降低从淀粉作物得到的加工食品中的丙烯酰胺水平的方法。这样 的方法应当是节省成本的，不会降低食品的感观特征。本发明提供了这样的方法。
【发明内容】
[0017] 在一个实施方案中，本发明提供了一种降低加工食品中的丙烯酰胺水平的新策 略，所述加工食品通过加热作物的淀粉组织来得到。独特地，该策略采用基因工程的方法， 使作物植物的淀粉组织中的天冬酰胺水平降低了至少50 %。
[0018] 在一个实施方案中，通过降低天冬酰胺生物合成的水平和/或增加天冬酰胺代谢 的水平，降低作物植物的淀粉组织中的天冬酰胺水平。任一种机理都可能需要下调或上调 直接或间接参与每个天冬酰胺途径的基因。在一个方面，参与天冬酰胺代谢的基因编码天 冬酰胺酶。在一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因编码天冬酰胺合成酶。
[0019] 在另一个方面，间接参与天冬酰胺途径的基因选自：谷氨酰胺合成酶（GS)基因， 硝酸还原酶（NR)基因，14-3-3基因，和己糖激酶（HXK)基因。
[0020] 在一个方面，通过降低参与天冬酰胺生物合成的至少一个基因的表达，降低天冬 酰胺生物合成的水平。
[0021] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，降低参与天冬酰胺生物合成的基因的表 达，所述表达盒从5'至3'包含，（i)启动子，（ii)包含参与天冬酰胺代谢的至少一个基因 的至少一个片段的序列的至少一个拷贝，和任选地，（iii)第二个启动子或终止子，其中所 述第一个和任选的第二个启动子以趋同方向排列。
[0022] 在一个方面，用于降低参与天冬酰胺生物合成的基因的表达的表达盒含有参与天 冬酰胺代谢的基因的至少一个片段的序列的2个拷贝。
[0023] 在一个方面，所述2个拷贝排列为（i)反向重复序列或（ii)直接重复序列。
[0024] 在一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因分离自：马铃薯，野生马铃薯例如 Solanum phureja,甘薯，山药，咖啡树，可可树，小麦，玉米，燕麦，高梁，或大麦，且 编码天冬酰胺合成酶。
[0025] 在一个方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含与SEQ ID: 1所示序列的至少一个片段 具有至少70 %同一性的序列。
[0026] 在另一个方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含与SEQ ID: 2所示序列的至少一个片 段具有至少70 %同一性的序列。
[0027] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，实现参与天冬酰胺代谢的基因的超量表 达，所述表达盒从5'至3'包含，第一启动子，参与天冬酰胺生物合成的基因，和终止子。
[0028] 在一个方面，参与天冬酰胺代谢的基因分离自：马铃薯，野生马铃薯例如Solanum phureja，甘薯，薯蓣，咖啡树，可可树，小麦，玉米，燕麦，高梁，或大麦，且编码天冬 酰胺酶。
[0029] 在一个方面，所述天冬酰胺酶基因包含与SEQ ID:9, 10, 14, 15, 31，32,或33所示 序列具有至少70%同一性的序列。
[0030] 在另一个方面，所述天冬酰胺酶基因包含与SEQ ID: 14所示序列具有至少70%同 一"性的序列。
[0031] 在另一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因是谷氨酰胺合成酶或己糖激酶基 因。
[0032] 在一个方面，所述启动子是下述基因的启动子：（i)马铃薯颗粒结合的淀粉合酶 基因，（ii)马铃薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，（iii)马铃薯泛素-7基因，（iv)马铃薯块 茎特异蛋白（patatin)基因，（V)马铃薯类黄酮单加氧酶基因。
[0033] 在一个方面，马铃薯颗粒结合的淀粉合酶基因的启动子与SEQ ID NO:8的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因的启动子与SEQ ID N0:7的 至少一部分具有至少70%同一性，马铃薯泛素-7基因的启动子与SEQ ID N0:21的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯块茎特异性蛋白基因的启动子与SEQ ID N0:22的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯类黄酮单加氧酶基因的启动子与SEQ IDN0:13的至少一 部分具有至少70%同一性。
[0034] 在另一个方面，所述启动子是在用于食品加工的淀粉作物的块茎、根或种子中表 达的基因的启动子。
[0035] 在另一个实施方案中，本发明提供了降低食品中丙烯酰胺水平的方法，所述食品 通过加热作物的组织并同时降低该组织中天冬酰胺和还原糖的水平来得到。在一个实施方 案中，所述组织是作物或植物的淀粉组织。
[0036] 在一个方面，通过下述方式实现天冬酰胺和还原糖水平的同时降低：（i)下调参 与天冬酰胺生物合成的基因的表达，或超量表达参与天冬酰胺代谢的基因，和（ii)下调参 与淀粉降解的至少一个基因的表达。
[0037] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，下调参与淀粉降解的基因的表达，所述表 达盒从5'至3'包含，（i)启动子，（ii)包含参与淀粉降解的基因的至少一个片段的序列 的至少一个拷贝，和任选地，（iii)第二个启动子或终止子，其中所述第一个和任选的第二 个启动子以趋同方向排列。
[0038] 在一个方面，参与淀粉降解的基因选自：（i)淀粉-相关的Rl基因，和（ii)淀 粉-相关的磷酸化酶-L基因。
[0039] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过同时降低组织中天冬酰胺和还原糖的水 平，降低通过加热作物的组织得到的食品中丙烯酰胺的水平并同时提高该食品的感官特征 的方法。在一个实施方案中，所述组织是作物或植物的淀粉组织。
[0040] 在一个方面，通过采用"多基因靶向"构建体，实现同时降低，所述"多基因靶向"构 建体包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含（i)可操作地连接到启动子上的 天冬酰胺酶基因，或（ii)可操作地连接到启动子上的天冬酰胺合成酶基因片段的至少一 个拷贝，所述第二表达盒包含DNA区段的至少一个拷贝，所述DNA区段含有可操作地连接到 启动子上的Rl基因片段和磷酸化酶基因片段，其中所述第一和第二表达盒可以是相同的 表达盒。
[0041] 在一个实施方案中，植物包含用"多基因靶向"构建体稳定转化的至少一个细胞。 在另一个实施方案中，所述植物是具有块茎的。在另一个实施方案中，所述具有块茎的植物 是马铃薯植物。在另一个实施方案中，所述具有块茎的植物含有稳定掺入它的基因组中的 盒。
[0042] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎加工的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，且（b)所述产品具有比从相同植物品种的非转基 因块茎生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度。
[0043] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎生产的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，（b)所述产品具有比从相同物种的非转基因块茎 生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度，且（c)所述产品还表现出比从相同物种的非转基因 块茎生产的等同产品更低的非酶性褐变速率。
[0044] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎生产的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，（b)所述产品具有比从相同物种的非转基因块茎 生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度，且（c)所述产品还表现出比从相同品种的非转基因 块茎生产的等同产品更低的非酶性褐变速率，且（d)所述产品还表现出比从相同品种的非 转基因块茎生产的等同产品增强的感官特征。在一个实施方案中，所述可食用的植物产品 具有比从没有根据本发明的方法修饰的植物生产的等同产品改善的感官特征。在一个实施 方案中，所述可食用的植物产品具有选自下述的至少一种改善的感官特征：外观，风味，香 气，和质地。
[0045] 在一个实施方案中，所述转基因块茎是马铃薯。在另一个实施方案中，所述产品是 炸薯条。在另一个实施方案中，所述产品是马铃薯片。
[0046] 在另一个实施方案中，所述转基因块茎是马铃薯，且所述转基因块茎产品在 4°C -12°C储存约1-30周时，其葡萄糖水平比在与该转基因块茎相同储存条件下储存的相 同物种的非转基因块茎的葡萄糖水平的50%还低。
[0047] 在一个实施方案中，所述植物选自：马铃薯，玉米，咖啡，可可，和小麦。
[0048] 在另一个实施方案中，用选自下述的细菌株转化所述植物：根癌农杆菌，三 叶草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛叶杆菌，苜蓿中华根瘤菌和百脉根中慢生根瘤菌 (MesoRhizobium loti)〇
[0049] 在一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸序列，其包含编码多肽的核酸序列，所 述多肽能降低植物中的天冬酰胺水平，并从而降低该植物的加工产品中的丙烯酰胺水平。
[0050] 在一个实施方案中，所述核酸序列与选自SEQ ID NO:9, 10, 14, 15, 31，32,和33的 序列或其变体或片段具有至少70%同一性，且所述核酸编码具有天冬酰胺酶活性的多肽。
[0051] 在另一个实施方案中，所述变体与SEQ ID N0:9, 10, 14, 15, 31，32,和33中的任 一个序列的序列同一性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %, 75 %,74%,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64%,63 %,62 %,61 % , 或 60%〇
[0052] 在另一个方面，提供了分离的多核苷酸序列，其包含编码天冬酰胺酶的核酸序列， 所述天冬酰胺酶能降低植物中的天冬酰胺水平，并从而降低该植物的加工产品中的丙烯酰 胺水平。
[0053] 在另一个方面，本发明提供了具有降低的天冬酰胺酶表达水平的转基因植物，其 可以用于生产含有低丙烯酰胺含量的加工食品。
[0054] 在另一个方面，本发明提供了具有低丙烯酰胺含量的食品，其可以通过加工具有 降低的天冬酰胺含量的转基因块茎得到。
[0055] 基于美国食品药品管理局数据（www. cfsan. fda. gov/_ dms/acrydata. html)，在 大量快餐连锁餐馆中生产的典型炸薯条含有超过十亿分之100份（PPb)的丙烯酰胺。这样 的典型炸薯条中丙烯酰胺的平均量是404ppb，通过消耗炸薯条平均每日摄入的丙烯酰胺水 平是0.07微克/kg体重/天。结果，炸薯条代表着16%的丙烯酰胺总饮食摄入。烘箱烘烤 的薯条和由商业处理机生产的马铃薯片中丙烯酰胺的平均量分别是698ppb和597ppb。因 而，马铃薯-衍生的加工食品（包括炸薯条，烘箱烘烤的薯条，和马铃薯片）代表着38% 的丙烯酰胺总饮食摄入。
[0056] 根据本发明，在从本发明的特定品种的转基因植物生产的块茎得到的炸薯条、烤 薯条或马铃薯片中存在的丙烯酰胺水平，比从相同品种的非转基因植物得到的炸薯条、烤 薯条或马铃薯片中的丙烯酰胺水平低超过2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10 倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，19倍，20倍，或超过20倍。
[0057] 以十亿分之......份表示，从本发明的块茎生产的炸薯条可以具有l_20ppb，20-40p pb, 40_60ppb, 60_80ppb,或 80-100ppb 的丙稀酰胺。
[0058] 以十亿分之……份表示，从本发明的块茎生产的烘箱烘烤的薯条、马铃薯片或薯 饼（hash brown)可以具有 l-2〇ppb，2〇-40ppb，4〇-6〇ppb，6〇- 8〇ppb，8〇-100ppb, IOO-I2Opp b, 120-140ppb, 140-160ppb, 160-180ppb,或 180-200ppb 的丙烯酰胺。
[0059] 本发明不限于降低块茎的油炸食品和马铃薯片产品中的丙烯酰胺水平。可以根据 本发明处理其它食物，以降低丙烯酰胺水平。
[0060] 早餐谷类中的丙烯酰胺水平可以从约50-250ppb降低至低于40ppb的水平，优选 降低至低于20ppb的水平。
[0061] 脆饼，如Dare Breton Thin Wheat Crackers和Wasa Original Crispbread Fiber Rye中的丙稀酰胺水平可以从约300_500ppb降低至低于IOOppb的水平，优选降低至低于 50ppb的水平。
[0062] 巧克力，如Ghirardelli无糖可可或Hershey可可中的丙稀酰胺水平可以从约 300_900ppb降低至低于200ppb的水平，优选降低至低于50ppb的水平。
[0063] 饼干中的丙烯酰胺水平可以从约50_200ppb降低至低于40ppb的水平，优选降低 至低于20ppb的水平。
[0064] 咖啡粉中的丙烯酰胺水平可以从约175_350ppb降低至低于60ppb的水平，优选降 低至低于30ppb的水平。
[0065] 小麦面包中的丙稀酰胺水平可以从约50_150ppb降低至低于30ppb的水平，优选 降低至低于15ppb的水平。
[0066] 应当理解，许多因素会影响最终的食品中的丙烯酰胺水平。这些因素包括作物、品 种、生长条件、收获的种子或块茎的贮存条件、和加工变量，例如加热稳定、加热时间、油炸 使用的油的类型和暴露的表面。
[0067] 本发明所述方法的应用，会使丙烯酰胺水平降低至少约5%、至少约10%、至少 约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、 50%，至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90 %或超过约90%。
[0068] 附图简述
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