CABIOS 5:151153(1989) ;Corpet,等人，Nucleic Acids Research 16:10881-90(1988) ;Huang， 等人，Computer Applications in the Biosciences 8:155-65(1992)，和 Pearson,等 人，Methods in Molecular Biology 24:307-331(1994)。
[0153] 可以用于数据库相似性检索的BLAST程序家族包括：针对核苷酸数据库序 列的核苷酸查询序列的BLASTN ;针对蛋白数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX ; 针对蛋白数据库序列的蛋白查询序列的BLASTP ;针对核苷酸数据库序列的蛋白查 询序列的TBLASTN ;和针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见， Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel,等人，Eds. , Greene Publishing 和 Wiley_Interscience，New York(1995) ;Altschul 等人，J. Mol. Biol·, 215:403-410(1990);和，Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)。
[0154] 用于进行BLAST分析的软件可公开得到，例如，通过国家生物技术信息中心 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。该算法包含，首先识别高评分序列对（HSP)，这通过识 别查询序列中的长度W的短字来实现，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或 满足一些正值的阈值评分T。T称作邻域字评分阈值。这些起始邻域字命中作为启动检索的 种子，所述检索会发现含有它们的更长的HSP。所述字命中然后沿着每个序列向两个方向延 伸，远至可以增加累积比对评分。如下计算累积评分：对于核苷酸序列，使用参数M(-对匹 配残基的奖励分；总是>〇)和N(错配残基的罚分；总是〈0)。对于氨基酸序列，使用评分矩 阵来计算累积评分。在下述情况时，停止每个方向的字命中延伸：累积比对评分从它的最大 达到值下降X ;累积评分达到O或以下，这归因于一个或多个负评分的残基比对的积累；或 达到任一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程 序（对于核苷酸序列）使用的缺省值是，字长（W)为11，期望值（E)为10,截止值为100, M =5，N = -4,和2条链的对比。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值是，字长（W)为 3,期望值（E)为 10，BL0SUM62 评分矩阵（SMHenikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 89:10915)。
[0155] 除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法也进行2个序列之间的相似性的统 计分析（参见，例如，Karlin&Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5877(1993))。 BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总概率（P (N))，它指示着2个核苷酸或氨基酸 序列之间随机发生匹配的概率。
[0156] 使用 CLUSTAL 比对方法（Higgins 和 Sharp(1989)CABI0S. 5:151153)，利用缺省 参数（GAP PENALTY =10, GAP LENGTH PENALTY =10)，可以进行序列的多种比对。使 用CLUSTAL方法的逐对比对的缺省参数是KTUPLE I，GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5和 DIAGONALS SAVED = 5〇
[0157] 下述运行参数优选地用于使用BLASTN测定比对和相似性，这导致多核苷酸序列 的 E 值和百分比同一性：Unix 运行命令：blastall-p blastn-d embldb-e 10 - G〇-E〇-r 1-v 30-b 30-i queryseq - o results ;参数是：-p程序名[字符串];-d数据库[字符 串];_e期望值（E)[实数];-G打开间隙的成本（零调用缺省行为）[整数];-E延伸空位 的成本（零调用缺省行为）[整数];- r核苷酸匹配的奖励（仅blastn)[整数];-V -行描 述的数目（V)[整数];_b显示的比对的数目（B)[整数];-i查询文件[文件输入];和-〇 BLAST报告输出文件[文件输出]任选的。
[0158] 由BLASTN、FASTA、BLASTP或类似算法生成的查询序列对一个或多个数据库序列 的"命中"，会比对和识别序列的类似部分。命中按照相似性程度和序列重叠的长度的顺序 来排列。数据库序列的命中通常代表在查询序列的仅一部分序列长度上的重叠。
[0159] BLASTN, FASTA和BLASTP算法也生成比对的"期望"值。期望值（E)指示着当检索 某些大小的数据库时，可以"期望"随机看到的对某些数目的连续序列的命中数目。期望值 用作确定对数据库（例如优选的EMBL数据库）的命中是否指示真实相似性的显著性阈值。 例如，指定给多核苷酸命中的〇. IE值被解释为是指，在EMBL数据库大小的数据库中，可能 期望到看到在比对的序列部分的0. 1匹配，仅仅随机地具有类似评分。通过该标准，多核苷 酸序列的比对的和匹配的部分则具有90%的概率是相同的。对于在比对的和匹配的部分具 有0. 01或更小的E值的序列，使用BLASTN或FASTA算法在EMBL数据库中随机发现匹配的 概率是1 %或更小。
[0160] 根据一个实施方案，"变体"多核苷酸，参考本发明的每个多核苷酸，优选地包含 具有与本发明的每个多核苷酸相同数目或比其更少的核酸、并且与本发明的多核苷酸比较 时，生成0. 01或更小的E值。也就是说，变体多核苷酸是具有至少99%概率与本发明多核 苷酸相同的任意序列，使用设定为上述参数的BLASTN、FASTA或BLASTP算法测得具有0. 01 或更小的E值。
[0161] 或者，本发明的变体多核苷酸会在严格条件下与SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或这些序列的互补序列、反向 序列或反向互补序列杂交。
[0162] 本发明也包括不同于公开的序列的多核苷酸，但是作为遗传密码简并的结果，其 编码与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的多肽。因而，作为保守取代的结果，本发明预 见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸 序列或它们的互补序列、反向序列或反向互补序列的序列的多核苷酸。另外，作为缺失和 /或插入总计小于10%总序列长度的结果，本发明也预见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或它们的互补序列、反向互补 序列或反向序列的序列的多核苷酸。
[0163] 除了与本发明的多核苷酸序列具有指定的百分比同一性以外，变体多核苷酸优选 地具有与本发明的多核苷酸共有的其它结构和/或功能特征。除了它们的一级结构与本 发明的多核苷酸具有高度的相似性以外，与本发明的多核苷酸具有指定程度的同一性或能 与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸，优选地具有至少一种下述特征：（i)它们含有读码 框或部分读码框，其编码基本上具有与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的功能性质的多 肽；或（ii)它们具有共同的结构域。
[0164] 元件和DNA序列的来源
[0165] 本文所述的任意或所有元件和DNA序列可以是一个或多个植物基因组内源的。因 此，在本发明的一个具体实施方案中，为最终的转运盒选择的所有元件和DNA序列都是待 转化的植物的基因组内源的或天然的。例如，所有序列可以来自马铃薯基因组。或者，一个 或多个元件或DNA序列可以是与待转化的植物物种不同的植物基因组内源的，但是其可以 在任意情况下在宿主植物细胞中起作用。这样的植物包括马铃薯，番茄，和苜蓿植物。本 发明也包括使用一个或多个来自与待转化的植物互交可孕的植物的遗传元件。
[0166] 在这点上，本发明的"植物"包括、但不限于，马铃薯，番茄，鳄梨，苜蓿，甜菜， 木薯，甘薯，大豆，豌豆，菜豆，玉米，小麦，稻，大麦，和高梁。因而，植物可以是单 子叶植物或双子叶植物。"植物"和"植物材料"也包括植物细胞，种子，植物后代，繁殖 体，无论是有性还是无性产生的，和它们中的任一种的子代，例如插条或种子。"植物材料" 可以是指植物细胞，细胞悬浮培养物，愈伤组织，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶， 根，芽，配子体，孢子体，花粉，种子，正在发芽的幼苗，和微孢子。植物可以处于各种 成熟阶段，可以生长在液体或固体培养物中，或罐中的土壤或合适的培养基中、温室或田地 中。导入植物中的先导序列、尾随序列或基因序列的表达可以是暂时的或永久的。
[0167] 在这方面，本发明的植物衍生的转运-DNA("P_DNA"）边界序列的核苷酸序列不同 于任意已知细菌-衍生的T-DNA边界序列，但是它的功能用于基本上相同的目的。也就是 说，P-DNA可以用于将一个多核苷酸转运和整合到另一个多核苷酸中。可以将P-DNA插入 肿瘤诱导质粒，例如替代常规T-DNA的来自农杆菌的Ti-质粒，并维持在细菌株中，正如常 规转化质粒一样。可以操纵P-DNA，以便含有需要的多核苷酸，后者用于通过细菌介导的植 物转化掺入植物基因组中。参见Rommens等人TO2003/069980, US-2003-0221213, US-2004 -0107455,和W02005/004585,它们都在本文中引作参考。
[0168] 因而，P-DNA边界序列与来自农杆菌物种（例如根癌农杆菌或发根农杆菌）的已 知 T-DNA 边界序列相差 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,或更多 个核苷酸。
[0169] P-DNA边界序列的核苷酸序列与农杆菌T-DNA边界序列的相似性不大于99 %、 98 %,97 %,96 %,95 %,94 %,93 %,92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %, 83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %, 68 %,67 %,66 %,65 %,64 %,63 %,62 %,61 %,60 %,59 %,58 %,57 %,56 %,55 %,54 %, 53%、52%、51%或 50%。
[0170] 开发了鉴别和分离来自植物（尤其是马铃薯和小麦）的转运DNA的方法，和使用 在本文中引作参考的US-2004-0107455中所述的边界基序共有序列。
[0171] 在这方面，本发明的植物衍生的DNA、例如任一种本文公开的序列、切割位点、区 域或元件是功能性的，如果它能促进它所连接的多核苷酸向另一个核酸分子（例如植物染 色体）中的转运和整合，转化频率是约99%、约98%、约97%、约96%、约95%、约94%、 约 93 %、约 92 %、约 91 %、约 90 %、约 89 %、约 88 %、约 87 %、约 86 %、约 85 %、约 84 %、 约 83 %、约 82 %、约 81 %、约 80 %、约 79 %、约 78 %、约 77 %、约 76 %、约 75 %、约 74 %、 约 73 %、约 72 %、约 71 %、约 70 %、约 69 %、约 68 %、约 67 %、约 66 %、约 65 %、约 64 %、 约 63 %、约 62 %、约 61 %、约 60 %、约 59 %、约 58 %、约 57 %、约 56 %、约 55 %、约 54 %、 约 53 %、约 52 %、约 51 %、约 50 %、约 49 %、约 48 %、约 47 %、约 46 %、约 45 %、约 44 %、 约 43 %、约 42 %、约 41 %、约 40 %、约 39 %、约 38 %、约 37 %、约 36 %、约 35 %、约 34 %、 约 33%、约 32%、约 31%、约 30%、约 29%、约 28%、约 27%、约 26%、约 25%、约 24%、约 23%、约22%、约21%、约20%、约15%，或约5%或至少约1%。
[0172] 可以修饰或突变任一种这样的转化相关的序列和元件，以改变转化效率。可以将 其它多核苷酸序列添加到本发明的转化序列上。例如，可以修饰它以具有5'-和3'-多克 隆位点或其它限制位点。例如，可以修饰本文公开的切割位点的序列，以增加来自附随载体 的主链DNA不整合到植物基因组中的概率。
[0173] 可以将任意的需要的多核苷酸插入本文所述的任意切割或边界序列之间。例如， 需要的多核苷酸可以是植物物种天然的野生型或修饰的基因，或它可以是来自非植物基因 组的基因。例如，当转化马铃薯植物时，可以制备包含可操作地连接到目标马铃薯基因或其 片段上的马铃薯特异性启动子和马铃薯特异性终止子的表达盒。表达盒可以含有其它马铃 薯遗传元件，例如与基因的5' -末端符合读码框地融合的信号肽序列，和马铃薯转录增强 子。本发明不限于这样的排列，可以构建转化盒，使得需要的多核苷酸尽管可操作地连接到 启动子上，但不会可操作地连接到终止子序列上。
[0174] 当从植物鉴定和分离转化-相关的序列或元件（例如本文所述的那些）时，且如 果该序列或元件随后用于转化相同物种的植物，该序列或元件可以描述为所述植物基因组 "天然的"。
[0175] 因而，"天然的"遗传元件是指天然存在于、源自或属于待转化植物的基因组的核 酸。以相同的脉络，术语"内源"也可以用于鉴别植物"天然的"特定核酸，例如，DNA或 RNA，或蛋白。内源是指起源自该生物体的元件。因而，从待转化的植物或植物物种的基因 组分离的、或从与待转化的植物物种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的任意的 核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生 的。换而言之，天然的遗传元件代表植物育种者可用于通过经典植物培育来改良植物的所 有遗传物质。根据本发明，天然核酸的任意变体也视作"天然的"。在这方面，"天然"核酸也 可以分离自植物或其性别相容的物种，并经修饰或突变，使得得到的变体的核苷酸序列与 从植物分离的未修饰的天然核酸的相似性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、 93 %,92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %, 78 %,77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64 %, 63%、62%、61%，或60%。天然核酸变体的核苷酸序列的相似性也可以小于约60%、小于 约55 %或小于约50%。
[0176] 从植物分离的"天然"核酸也可以编码从该核酸转录和翻译的天然存在的蛋白产 物的变体。因而，天然核酸可以编码这样的蛋白，它与在分离核酸的植物中表达的未修饰 的天然蛋白的氨基酸序列的相似性大于或等于99 %、98 %、97 %、96 %、95 %、94 %、93 %、 92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %, 77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64 %,63 %, 62%、61%，或 60%。
[0177] 启动子
[0178] 本发明的多核苷酸可以用于特异性地指导多肽或蛋白在植物组织中的表达。本 发明的核酸也可以用于特异性地指导反义RNA或参与RNA干扰（RNAi)的RNA例如小干扰 RNA(SiRNA)在植物组织中的表达，其可以用于抑制或完全阻断靶基因的表达。如本文使用 的，"编码产物"是指可操作地连接到启动子上的核酸的最终产物。例如，蛋白或多肽是编码 产物，以及反义RNA或siRNA，它是编码反义RNA的核酸的最终产物。编码产物也可以是未 翻译的mRNA。术语多肽和蛋白在本文中可互换地使用。如本文所使用的，启动子是指核酸， 优选结合RNA聚合酶和/或其它转录调节元件的DNA。象任意的启动子一样，本发明的启动 子会促进或控制DNA或RNA的转录，以从可操作地连接到启动子上的核酸分子产生mRNA分 子。RNA可以编码蛋白或多肽，或可以编码RNA干扰或反义分子。如本文使用的，"可操作 地连接到"是指DNA的化学融合、连接或合成，使得启动子-核酸序列组合以适合将所述核 酸序列转录成RNA区段的方向形成。本发明的启动子也可以含有得到的mRNA转录物的一 些或所有5'非翻译区（5'UTR)。另一方面，本发明的启动子不一定需要具有任何5'UTR。
[0179] 本文使用的启动子也可以包括调节元件。相反地，调节元件也可以与启动子分开。 调节元件会将许多重要特征赋予给启动子区域。有些元件会结合转录因子，后者增强可操 作地连接的核酸的转录速率。其它元件会结合抑制转录活性的阻抑物。转录因子对启动子 活性的影响，可能决定启动子活性是高还是低，即所述启动子是"强"还是"弱"。
[0180] 在另一个实施方案中，组成型启动子可以用于表达本发明的多核苷酸序列。
[0181] 在另一个实施方案中，许多诱导型植物基因启动子可以用于表达本发明的多核苷 酸序列。诱导型启动子会调节反应于环境、激素或化学信号的基因表达。激素诱导型启动 子的实例包括植物生长素诱导型启动子（Baumann等人，Plant Cell 11:323-334(1999))， 细胞分裂素诱导型启动子（Guevara-Garcia Plant Mol. Biol. 38:743-753(1998))，和赤霉 素反应性性启动子（Shi等人，Plant Mol.Biol.38:1053-1060(1998))。另外，反应于热、 光、创伤、病原体抗性和化学物质（例如茉莉酮酸甲酯或水杨酸）的启动子，可以用于表达 本发明的多核苷酸序列。
[0182] 在一个实施方案中，所述启动子是颗粒结合的淀粉合酶启动子，马铃薯ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶基因启动子，或类黄酮3'-单加氧酶基因启动子。在另一个实施方案中，所 述启动子是种子特异性启动子。
[0183] 本发明也包括不同于公开的序列的多核苷酸，但是作为遗传密码简并的结果，其 编码与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的多肽。因而，作为保守取代的结果，本发明预 见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸 序列或它们的互补序列、反向序列或反向互补序列的序列的多核苷酸。另外，作为缺失和 /或插入总计小于10%总序列长度的结果，本发明也预见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4,