069] 图 I: (A)pSM1148, (B)pSM1151,和（C)pSM658 的简图。LB =左 T-DNA 边 界，P:Agp =马铃薯Agp启动子，2a = ast2基因片段的反义拷贝，la = astl基因片段的 反义拷贝，lb = astl基因片段的有义拷贝，2b = ast2基因片段的有义拷贝，P:Gbss =马 铃薯Gbss启动子，T:nos =农杆菌胭脂碱合酶基因的终止子，P:nos =农杆菌胭脂碱合酶 基因的启动子，RB =右T-DNA边界，P:Ubi7 =马铃薯泛素-7基因的启动子。
[0070] 图2:Russet Boise构建体。PF =启动子片段，GF =基因片段。
[0071] 优选实施方案的详述
[0072] 本发明提供了用于降低丙烯酰胺水平的多核苷酸序列和方法。
[0073] 本发明使用本领域技术人员众所周知的术语和短语。如果没有另外定义，此 处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的 相同含义。一般地，本文使用的命名，细胞培养、分子遗传学和核酸化学中的实验方法， 和在此描述的杂交是本领域公知和常用的。对于重组核酸方法、多核苷酸合成、微生物 培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学 分析和药物制剂和递送，使用标准技术。一般地，根据厂家的说明进行酶促反应和纯化 和 / 或分离步骤。一般根据常规方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, edited by Sambrook&Russel Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，2001)，进行这些技术和操作。
[0074] 丙烯酰胺：丙烯酰胺单体被认为是有毒的，会直接影响神经系统。它被视作致 癌物。丙烯酰胺会容易地透过完整皮肤从水溶液吸附。分子式是C3H5N0;结构：CH2 = CH-C0-NH2。
[0075] 农杆菌或细菌转化：如本领域众所周知的，用于转化植物细胞的重组质粒转化农 杆菌通常是根癌农杆菌或发根农杆菌的减毒（disarmed)和有毒的衍生物。在感染植株、外 植体、细胞或原生质体后，农杆菌会将DNA区段从质粒载体转移至所述植物细胞核。所述载 体通常含有位于T-DNA或P-DNA的边界之间的需要的多核苷酸。但是，可以使用能转化植 物细胞的任意细菌，例如，三叶草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛叶杆菌，苜蓿中华根瘤菌和 百脉根中慢生根瘤菌。
[0076] 被子植物：具有包裹在子房中的种子的维管植物。被子植物是开花的种子植物， 所述花生产果实。被子植物分为双子叶和单子叶植物。
[0077] 天冬酰胺生物合成：在植物中发生的生成天冬酰胺的酶催化的反应。
[0078] 天冬酰胺代谢：在植物中发生的将天冬酰胺转化成其它化合物的酶催化的反应。
[0079] 天冬酰胺酶：在多种植物、动物和细菌细胞中发现的天冬酰胺酶，是参与天冬酰 胺代谢的酶。它会催化天冬酰胺的脱氨作用，产生天冬氨酸和铵离子，导致游离循环天冬酰 胺的消耗。
[0080] 天冬酰胺合成酶：该酶参与天冬酰胺生物合成，并催化从天冬氨酸合成天冬酰 胺。
[0081] 抗生素抗性：细胞在有抗生素存在下存活的能力。本文使用的抗生素抗性源自抗 生素抗性基因在宿主细胞中的表达。细胞可以具有对任意抗生素的抗性。常用抗生素的实 例包括卡那霉素和潮霉素。
[0082] 双子叶植物：胚具有2瓣种子或子叶的开花植物，分支叶脉，花瓣数是4或5的倍 数。双子叶植物的实例包括、但不限于，马铃薯，甜菜，绿花椰菜，木薯，甘薯，胡椒， 猩猩木，菜豆，苜蓿，大豆，和鳄梨。
[0083]内源的：从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物 种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或 cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。
[0084] 表达盒：多核苷酸，其从5'至3'包含，（a)第一个启动子，（b)包含⑴基因或 基因片段的至少一个拷贝或（ii)基因启动子片段的至少一个拷贝的序列，和（c)以与第一 个启动子相反方向排列的终止子或第二个启动子。
[0085] 外源的：关于核酸"外源的"是指，该核酸来源于非植物生物体、或来源于与待转 化的植物不同物种的植物、或来源于与待转化植物不是互交可孕的植物，不属于目标植物 的物种。根据本发明，外源的DNA或RNA代表天然地存在于真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼 或鸟类的遗传组成中，但不天然地存在于待转化的植物中的核酸。因而，外源核酸是编码核 酸，例如，编码不由被转化植物天然地产生的多肽。外源核酸不是必须编码蛋白产物。
[0086] 基因：基因是含有合成产物、多肽链或RNA分子所需的所有信息的DNA分子区段， 其包含编码序列和非编码序列。基因也可以代表多个序列，它们中的每一个可以独立表达， 或可以编码表现出相同功能活性的轻微不同的蛋白。例如，天冬酰胺合成酶1和2基因可 以统一称作一个基因。
[0087] 遗传元件："遗传元件"是任意离散的核苷酸序列，例如、但不限于，启动子，基因， 终止子，内含子，增强子，间隔区，5' -非翻译区，3' -非翻译区，或重组酶识别位点。
[0088] 遗传修饰：通过应用分子和细胞生物学方法，将DNA稳定导入某些生物体的基因 组中。
[0089] 裸子植物：如本文使用的，指具有没有子房的种子的种子植物。裸子植物的实例 包括针叶树，苏铁科植物，银杏，和麻黄。
[0090] 导入：如本文使用的，是指通过包括感染、转染、转化和转导的方法将核酸序列插 入到细胞中。
[0091] 单子叶植物：胚芽具有一个子叶或籽叶的开花植物，平行叶脉，花瓣数是3的倍 数。单子叶植物的实例包括、但不限于，玉米，稻，燕麦，小麦，大麦，和高梁。
[0092] 天然的：从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物种 在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或 cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。
[0093] 天然DNA:从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物 种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的任意核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA 或cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。换而言之，天然的遗传元件代表植 物育种者通过经典植物育种来改进植物所可以使用的所有遗传物质。根据本发明，天然核 酸的任何变体也认为是"天然的"。例如，天然DNA可以包含点突变，因为这样的点突变会天 然发生。通过采用限制位点，也可以连接2个不同的天然DNA，因为这样的位点普遍存在于 植物基因组中。
[0094] 天然核酸构建体：包含至少一个天然DNA的多核苷酸。
[0095] 可操作地连接：以这样的方式组合两个或多个分子，从而使它们在植物细胞中以 组合方式适当地起作用。举例来说，当启动子控制结构基因的转录时，启动子可操作地连接 到结构基因。
[0096] 超量表达：基因的表达水平高于在非转基因植物中的水平。
[0097] P-DNA:本发明的植物衍生的转运-DNA( "P-DNA"）边界序列的核苷酸序列不同于 任意已知细菌-衍生的T-DNA边界序列，但是它的功能用于基本上相同的目的。也就是说， P-DNA可以用于将一个多核苷酸转运和整合到另一个多核苷酸中。可以将P-DNA插入肿瘤 诱导质粒，例如替代常规T-DNA的来自农杆菌的Ti-质粒，并维持在细菌株中，正如常规转 化质粒一样。可以操纵P-DNA，以便含有需要的多核苷酸，后者用于通过细菌介导的植物转 化整合到植物基因组中。参见 Rommens 等人，W02003/069980, US-2003-0221213, US-2004-0107455,和W02005/004585,它们都在本文中引作参考。
[0098] 表型：表型是植物的区别特征或特性，通过将一个或多个"需要的多核苷酸"和/ 或筛选/选择标记整合到转化的植物的至少一个植物细胞的基因组中，可以根据本发明改 变表型。"需要的多核苷酸"和/或标记可以赋予转化的植物的表型的变化，这通过修饰转 化的植物细胞或植物整体的许多遗传、分子、生化、生理学、形态学或农学特征或性质中的 任意一种来实现。因而，一个或多个稳定整合的需要的多核苷酸在植物基因组中的表达，会 在植物组织中产生降低的丙烯酰胺浓度的表型。
[0099] 植物组织："植物"是植物界许多光合的、真核的、多细胞生物体中的任一种，其特 征性地生成胚、含有叶绿体且具有纤维素细胞壁。可以根据本发明的方法处理植物的一部 分即"植物组织"，以生产转基因植物。根据本发明可以转化许多合适的植物组织，包括、但 不限于，体细胞胚，花粉，叶，茎，愈伤组织，匍匐茎，微块茎，和芽。因而，本发明预见 到被子植物和裸子植物的转化，所述植物例如小麦，玉米，稻谷，大麦，燕麦，甜菜，马 铃薯，番茄，苜蓿，木薯，甘薯，和大豆。根据本发明，"植物组织"也包括植物细胞。植 物细胞包括悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、 花粉、种子和微孢子。植物组织可以处于各种成熟阶段，可以生长在液体或固体培养基中， 或在土壤中或在罐的合适培养基中、温室或田地中。植物组织也指这样的植物、种子、后代、 繁殖体的任意克隆，无论是有性还是无性产生的，和它们的后代，例如插条或种子。特别感 兴趣的是马铃薯，玉米，和小麦。
[0100] 植物转化和细胞培养：泛指遗传修饰植物细胞，并转移到适合的植物培养基，用于 维持、进一步生长、和/或进一步发育的过程。这样的方法是本领域技术人员众所周知的。
[0101] 加工：从下述物质生产食品的过程：（1)种子，例如，小麦、玉米、咖啡植物或可可 树的种子，（2)块茎，例如，马铃薯块茎，或（3)根，例如，甘薯和山药的根，包含加热至至少 120°C。加工食品的实例包括面包、早餐谷类、馅饼、蛋糕、土司、饼干、小甜饼、比萨饼、椒盐 卷饼、玉米饼、炸薯条、烤薯条、马铃薯片、薯饼、烘烤的咖啡，和可可。
[0102] 后代：本发明的"后代"，例如转基因植物的后代，是由植物或转基因植物生出的、 产生的或衍生的后代。因而，"后代"植物，即"F1"代植物，是通过本发明的方法生产的转 基因植物的子代或后代。转基因植物的后代可以含有它的至少一个、一些或全部细胞基因 组，通过本文所述的方法将需要的多核苷酸整合到亲本转基因植物的细胞中。因而，需要的 多核苷酸由后代植物"传递"或"遗传"。这样在后代植物中遗传的需要的多核苷酸可以停 留在T-DNA或P-DNA构建体内，后者也可以由后代植物从它的亲本遗传。本文使用的术语 "后代"也可以视作一组植物的子代或后代。
[0103] 启动子：启动子意在指核酸，优选结合RNA聚合酶和/或其它转录调节元件的 DNA。象任意的启动子一样，本发明的启动子会促进或控制DNA或RNA的转录，以从可操作地 连接到启动子上的核酸分子产生mRNA分子。如前所述，产生的RNA可以编码蛋白或多肽， 或可以编码RNA干扰或反义分子。
[0104] 启动子是核酸序列，它使与它相关的基因被转录。在原核生物中，启动子通常由在 基因上游-10和-35位置的2个短序列组成，也就是说，在转录方向上是在基因前面。在-10 位置的序列称作普里布诺盒，通常由6个核苷酸TATAAT组成。普里布诺盒是原核生物开始 转录所必需的。在-35位置的另一个序列通常由6个核苷酸TTGACA组成，它的存在会促进 转录速率。
[0105] 真核启动子是更多样的，因此更难以表征，但是存在某些基本特征。例如，真核启 动子通常位于它们最密切相关的基因的上游。启动子可以具有距离它们的转录起点数千 碱基的调节元件，尽管转录复合物形成的某些三级结构可以造成DNA的折叠，这会使这些 调节元件更接近实际转录位点。许多真核启动子含有"TATA盒"序列，通常用核苷酸序列 TATAAA指示。该元件会结合TATA结合蛋白，它辅助RNA聚合酶转录复合物的形成。TATA 盒通常位于转录起点的50碱基内。
[0106] 真核启动子的特征也在于存在某些调节序列，它们结合参与形成转录复合物的转 录因子。一个实例是序列CACGTG指示的E-盒，它会结合基本的螺旋-环-螺旋家族中的 转录因子。也存在高GC核苷酸含量的区域。
[0107] 因此，根据本发明，可以用于设计本发明的需要的多核苷酸的启动子的部分序列 或特定启动子"片段"，例如天冬酰胺合成酶基因的启动子，可以包含或不包含一个或多个 这样的元件或没有这样的元件。在一个实施方案中，本发明的启动子片段序列不是功能性 的，且不含有TATA盒。
[0108] 本发明的构建体的另一个特征是，它会通过2个相反启动子，促进与或不与终止 子直接可操作地相连的多核苷酸的一个或多个拷贝的趋同转录。由于缺失终止信号，从第 一个和第二个启动子转录的RNA分子集合的长度可以是不同的长度。
[0109] 偶然地，例如，转录机制可能继续转录，越过象征着需要的多核苷酸序列的"末端" 的最后一个核苷酸。因此，在该特定排列中，转录终止可能通过下游序列的微弱的或非预期 作用（例如，促进发夹形成）来发生，或通过位于侧接转运DNA整合位点的植物DNA中的非 预期转录终止子的作用来发生。
[0110] 需要的多核苷酸可以以2个不同的方向连接至启动子上。在一个方向，例如"有 义"方向，得到的RNA转录物的至少5' -部分与至少一种靶转录物的至少一部分具有序列 同一性。在指定为"反义"的另一个方向，预测转录物的至少5'-部分与至少一种靶转录物 的反向互补序列的至少一部分相同或同源。
[0111] 植物启动子是能启动在植物细胞中的转录的启动子，无论它的起源是否是植物细 胞。示例性植物启动子包括、但不限于，从包含要在植物细胞中表达的基因的植物、植物病 毒和细菌（例如农杆菌或根瘤菌）得到的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括，优 先启动在某些组织（例如木质部，叶，根，或种子）中的转录的启动子。这样的启动子称 作组织优选的启动子。仅启动在某些组织中的转录的启动子称作组织特异性的启动子。细 胞类型特异性的启动子主要驱动在一个或多个器官的某些细胞类型（例如，根或叶中的维 管细胞）中的表达。诱导型或抑制型启动子是在环境控制下的启动子。可能影响诱导型启 动子的转录的环境条件的实例包括缺氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞 类型特异性的和诱导型的启动子构成非组成型启动子的类型。组成型启动子是在大多数环 境条件下和在大多数植物部分中有活性的启动子。
[0112] 多核苷酸是核苷酸序列，其包含基因编码序列或其片段（包含至少15个连续核苷 酸，优选至少30个连续核苷酸，和更优选至少50个连续核苷酸），启动子，内含子，增 强子区域，聚腺苷酸化位点，翻译起始位点，5'或3'非翻译区，报道基因，选择标记等。 多核苷酸可以包含单链或双链DNA或RNA。多核苷酸可以包含修饰的碱基或修饰的主链。 多核苷酸可以是基因组的、RNA转录物（例如mRNA)或加工过的核苷酸序列（例如cDNA)。 多核苷酸可以包含有义或反义方向的序列。
[0113] 分离的多核苷酸是并非处于它的天然状态的多核苷酸序列，例如，该多核苷酸包 含天然不存在的核苷酸序列，或该多核苷酸与它通常接近的核苷酸序列分离，或接近与它 通常不接近的核苷酸序列。
[0114] 种子："种子"可以视作含有胚的成熟的植物胚珠，和植物的繁殖部分，作为块茎或 孢子。种子可以在农杆菌介导的转化之前在黑暗中温育，例如，以促进萌芽。种子也可以在 温育前灭菌，例如通过用漂白剂简单处理。得到的幼苗然后可以暴露于目标农杆菌菌株。
[0115] 选择/筛选标记：在植物或植物组织中表达时，可以将它们与不表达该基因的其 它植物或植物组织区分开的基因。筛选操作可能需要测定由筛选标记基因编码的蛋白的表 达。选择标记的实例包括编码卡那霉素和遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶（NptII)基 因，编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶（HptII)基因，或其他本领域已知的类似基因。
[0116] 感官特征：专业训练的个体组可以评定食品的感官特征，例如外观，风味，香气， 和质地。在实施例4中，描述了从Rl和磷酰酶-L基因表达水平下调的块茎得到的炸薯条 的等级。从实施例5所述的块茎得到的炸薯条也表现出增强的感官特征。因而，本发明预 见到，提高从已经根据本发明修饰的植物得到的植物产品的感官特征，以操纵它的天冬酰 胺生物合成和代谢途径。
[0117] 序列同一性：在2个核酸或多肽序列的情况下，本文使用的"序列同一性"或"同 一性"包括，当进行比对以得到指定区域上的最大相应性时，2个序列中相同的残基。当 序列同一性百分比用于指蛋白时，认识到不相同的残基位置的差别经常在于保守氨基酸 置换，其中将氨基酸残基置换为具有类似化学性质（例如电荷或疏水性）的其它氨基酸 残基，因此不会改变分子的功能性质。当序列的差异在于保守置换时，可以向上调节序列 同一性百分比，以校正置换的保守性质。差异在于这样的保守置换的序列，被描述为具有 "序列相似性"或"相似性"。进行该调节的方法，是本领域技术人员众所周知的。通常， 这包含，将保守置换评定为部分的、而不是完全的错配，从而增加序列同一性百分比。因 而，例如，当为相同的氨基酸给出1分、且为非保守置换给出〇分时，为保守置换给出〇 至1之间的分数。计算保守置换的评分，例如，根据Meyers和Miller的算法，Computer Applic. Biol. Sci.，4:1117 (1988)例如，在程序 PC/ 基因（Intelligenetics, Mountain View, California, USA)中实现。
[0118] 如本文使用的，序列同一性百分比是指通过在对比窗中对比2个最优比对的序列 而确定的值，其中多核苷酸序列在对比窗中的部分可以相对于用于2个序列的最优比对的 参照序列（它不包含添加或缺失）包含添加或缺失（即，空位）。如下计算百分比：通过测 定2个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以确定匹配位置的数目，将 匹配位置的数目除以对比窗中的位置总数，并将结果乘以100,以确定序列同一性百分比。
[0119] "序列同一性"具有本领域公知的含义，且可以使用公开的技术来计算。参见 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk,编（Oxford University Press,1988) ,BI0C0MP UTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith,编（Academic Press,1993) ,COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,PART I,Griffin&Griffin,编·， （Humana Press,1994) ,SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed·，Academic Press(1987)，SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gr