4] 实施例4
[0235] 同时下调淀粉降解和天冬酰胺生物合成基因的表达
[0236] 本实施例证实，同时下调分别参与作物淀粉组织的淀粉降解和天冬酰胺生物合成 基因的表达，可以降低加热这些淀粉组织得到的食物中的丙烯酰胺积累。
[0237] 分2步制备转基因植物，其生产具有低水平的还原糖和天冬酰胺的块茎。首先，用 二元载体 PSIM371 的 P-DNA 转化植物。该 P-DNA 含有包含 PP0(SEQ ID N0:18)、R1(SEQ ID N0:19)和phL(SEQ ID N0:20)基因的片段的多核苷酸的2个拷贝，其作为反向重复序列插 入Gbss启动子和Ubi 3终止子之间。
[0238] 使用携带pSM371和LifeSupport载体pSM368的农杆菌株（它含有插入在T-DNA 边界之间的nptll和codA基因的表达盒）来感染21，900个马铃薯茎外植体。2天共培养 阶段后，将感染的外植体暴露于卡那霉素5天，以选择瞬时nptll基因表达。为了预防含 有稳定整合的T-DNA的细胞的增殖，随后将外植体转移至含有5-氟胞嘧啶（5FC)的培养基 中。codA基因产物会将该化合物转化成无毒的5-氟尿嘧啶（5FU) (Perera等人，1993)。对 双重选择后存活的共3, 822个芽进行基因型分析，分析P-DNA的存在和来自T-DNA或质粒 主链的任意外源DNA的缺失。该分析鉴定出256个能生根的全天然DNA(基因内的）芽，种 入土壤中，在生长室中生长6周。为了筛选PPO活性，将儿茶酚溶液移液到收获的约2-cM 小块茎的切口表面上。在温室中培养在儿茶酚诱导的块茎褐变中抑制的48个系3个月，以 生产半成熟的块茎，用于生化分析剩余的PPO活性水平。该分析证实，PPO基因沉默构建体 的应用使PPO活性降低了约90%。随后繁殖48个基因内系和未转化的Ranger Russet和 Russet Burbank对照植物，并在爱达荷州阿柏丁（Idaho, Aberdeen)的田地中生长。
[0239] 在冷藏3和6个月后，分析所有基因内系和对照系的成熟块茎的葡萄糖水平。大 多数系（43)表现出比已经沉默了仅一个淀粉相关基因的对照系更大的冷诱导的甜化减少 (约60% )。源自植物371-28和371-38的沉默块茎的炸薯条含有的神经毒素丙烯酰胺少 于在对照油炸食品中积累的1/3(表4)。可以的减少在预料之中，因为丙烯酰胺主要源自热 诱导的还原糖羰基和天冬酰胺之间的反应（Mottram等人，2002 ;Stadler等人，2002)。
[0240] 由8位专业训练的个体组评价改良的炸薯条的感官特征。源自修饰的Ranger Russet块莖的炸薯条表现出比来自Ranger Russet或Russet Burbank的炸薯条更好的视 觉外观。此外，基因内的炸薯条表现出明显更好的总香气，这可以通过位于鼻腔顶部的嗅觉 上皮感知。对于已经在4°C储存10周的块茎，观察到了类似的趋势。实际上，冷藏的基因内 系371-28, 30, 38,和68仍然满足或超过了新鲜的未转化的品种的感官特征。
[0241] 用PSM1148再次转化一种低糖马铃薯系。与来自原始pSM1148植物的炸薯条相 比，来自卡那霉素抗性的双重转化体的炸薯条通常表现出进一步降低的丙烯酰胺水平。因 而，该双重转化体会生成可以用于得到炸薯条的块茎，所述食品（i)含有降低水平的丙烯 酰胺，且（ii)表现出增强的感官特征。
[0242] 实施例5
[0243] 降低马铃薯块茎中的天冬酰胺水平和冷诱导的甜化的全天然DNA转化方法
[0244] 本实施例描述了使用全天然DNA转化方法来降低马铃薯块茎中的天冬酰胺水平 和冷诱导的甜化。从这些块茎得到的加工食品含有降低水平的丙烯酰胺。
[0245] 用于转化的含有插入马铃薯-衍生的边界区域之间的2个表达盒的转运DNA如 SEQ ID N0:23 所示（图 2)。第一表达盒包含含有 Ppo(SEQ ID N0:24)、PhL(SEQ ID N0:25) 和Rl (SEQ ID N0:26)基因的启动子片段的DNA区段的2个拷贝，其作为反向重复序列插入 Agp基因的功能活性启动子和泛素-3基因的终止子之间。第二表达盒包含含有Astl、Ast2 和Pp0 (SEQ ID NO: 27)基因的片段的DNA区段的2个拷贝，其作为反向重复序列插入Gbss 基因的2个功能活性的和趋同方向的启动子之间。
[0246] 将含有转运DNA和农杆菌异戊烯基转移酶（ipt)基因的表达盒的质粒导入农杆菌 LBA4404,使用无标记的转化方法（参见：Craig Richael, "generation of marker-free and backbone-free transgenic plants using a single binary approach，临时专利申 请60/765, 177,它在本文中引作参考），将得到的菌株用于转化马铃薯品种，例如Ranger Russet和Atlantic。使没有表现出细胞因子表型（特征是矮化的生长和不能生根）的转 化过的植物生成块茎。有些系的块茎会表现出低水平的Ppo酶活性，这可以通过将0. 5mL 的50mM儿茶酚移液到新鲜切口的块茎表面上来测试。通过在50mM 3-(N-吗啉代）丙磺酸 缓冲液PH 6.5 (5mL)中混合粉末状的块茎（Ig)，可以更精确地测定Ppo酶活性的水平。沉 淀固体级分后，可以随时间测定0D410的变化。通过在约4°C温育块茎，进一步测试含有小 于25% Ppo酶活性的块茎的系。至少1个月后，可以测定葡萄糖水平，例如，通过使用葡萄 糖氧化酶/过氧化物酶试剂（Megazyme, Ireland)。可以分析表现出>75%降低的ppo活性 水平和>50%降低的冷诱导的甜化的块茎的系的游离天冬酰胺水平。如果游离天冬酰胺水 平降低了约>50%，可以加工块茎，并分析丙烯酰胺水平。确实含有低天冬酰胺水平以及低 Ppo和低的冷诱导的甜化的转化系，可以考虑用于批量扩大和商业生产。源自优选系的块茎 的炸薯条含有更少的还原糖，因而可能减少漂白时间和保持原始的马铃薯味道。此外，由于 缺少糖末端和黑点挫伤，增强了它们的视觉吸引力。炸薯条也具有更好的香气，并积累降低 水平的丙烯酰胺，这可以通过用于评价炸薯条的感官特征的感官组来测定。
[0247] 实施例6
[0248] TILLING
[0249] 通过突变，也可以下调参与天冬酰胺（例如天冬酰胺合成酶）的生物合成的基因 的表达。实现该目标的一种方法称作'靶向诱导的基因组中的局部损伤'（TILLING)。该方 法组合了甲磺酸乙酯（EMS)-诱导的诱变的效率和变性高效液相色谱（DHPLC)的能力，以通 过异源双链体分析检测碱基对变化。该方法会产生宽范围的突变等位基因，是快速且可自 动化的，适用于可以化学诱变的任意生物体。在基本的TILLING方法中，通过EMS处理来 诱变种子。使得到的Ml植物自受精，将M2代个体用于制备进行突变筛选的DNA样品，同 时将它们的种子存货。合并DNA样品。在微量滴定板上排列各样品组，进行基因特异性的 PCR (McCal Ium 等人，Nat Biotechnol 18:455-457)。
[0250] TILLING有多种替代方案。例如，可以使用不同类型的诱变剂，例如快速中子或二 环氧丁烷（DEB)。所有这些方法可以连接到反向遗传学平台，以筛选和分离预选择的基因的 突变体。这些方法已经详细描述在，例如，Wang等人，Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology, Volume I,2006,Global Science Books。
[0251] 此外，可以简单地筛选可得到的种质的低天冬酰胺表型。因而，分子植物培育、突 变培育和系选择都会提供可以得到'低天冬酰胺'品种的方法。
[0252] 实施例7
[0253] 降低天冬酰胺水平
[0254] 通过改进种植者的操作，也可以降低天冬酰胺水平。例如，碳可以抑制天冬酰胺 合成酶基因 (Koch KE. Carbohydrate-modulated gene express ion in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol47:509_540, 1996)。通过降低土壤中的氮/硫比，也可以 减少天冬酰胺积累。相对较低的氮水平会导致富含N的化合物的浓度的降低和含S代谢物 (例如半胱氨酸，谷胱甘肽，和S-腺苷酰甲硫氨酸）的增加。因而，含有相对高C、高S和 低N的土壤可以用于生产具有相对低天冬酰胺的食品。
[0255] 表
[0256] 表1. 3个月龄的温室生长的马铃薯系的块茎中的天冬酰胺水平
[0257]
[0258]
[0259] 表2.从3个月龄的温室生长的马铃薯系的块茎得到的炸薯条中的丙烯酰胺水平。 根据美国食品和药品管理局，植物以及乳制品和饮料的食品安全中心和应用营养办公室， "食品中丙烯酰胺的检测和定量"（2002)，测定丙烯酰胺水平。
[0260]
[0261] 表3.通过定量实时RT-PCR测得的6周龄生长室生长的马铃薯系的马铃薯块茎中 天冬酰胺酶-1基因的表达水平
[0262]
^ Im ο η ΓΕν
[0263] 表^从3个月龄温室生长的马铃薯系
块茎得到^勺炸薯条中的丙'酰胺水平
[0264]
【主权项】
1. 一种降低热加工的植物产品中的丙烯酰胺含量的方法，其包含降低用于生产该产品 的植物中的天冬酰胺水平。2. 权利要求1的方法，其中降低天冬酰胺水平的步骤包含：在植物中表达第一多核苷 酸，其中所述多核苷酸包含至少一个下述成分的完整或部分序列：（i)参与天冬酰胺生物 合成的基因或基因的启动子，和（b)参与天冬酰胺代谢的基因。3. 权利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸包含下述成分的至少一个：(a)来自选自 (i)天冬酰胺合成酶基因、（ii)硝酸还原酶基因、和（iii)己糖激酶基因的基因或所述基因 的启动子的完整或部分有义和/或反义序列，其中完整或部分序列的表达下调该基因的内 源拷贝的mRNA水平，和（b)选自（i)天冬酰胺酶基因和（ii)谷氨酰胺合成酶基因的基因 的完整或部分序列，其中超量表达所述序列，以上调该基因的总mRNA水平。4. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含天冬酰胺合成酶基因的至少一部 分，且包含与SEQIDNO: 1或2所述序列的至少一部分具有至少70%同一性的序列。5. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含功能上有活性的天冬酰胺酶基因， 且包含与SEQIDN0:9、14或31-33所述序列具有至少70%同一性的序列。6. 权利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸可操作地连接到至少一个组织特异性植 物启动子上。7. 权利要求6的方法，其中所述启动子是块茎特异性或种子特异性启动子。8. 权利要求7的方法，其中所述启动子与马铃薯颗粒结合的淀粉合酶启动子、马铃薯 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子、马铃薯块茎特异性蛋白启动子、马铃薯类黄酮3' -单 加氧酶基因启动子、或小麦嘌呤吲哚基因启动子的至少一部分具有至少70%同一性。9. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯颗粒结合的淀粉合酶启动子包含SEQIDNO:8 所述序列的至少一部分。10. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子包含SEQ IDN0:7所述序列的至少一部分。11. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯块茎特异性蛋白基因启动子包含SEQID NO:22所述序列的至少一部分。12. 权利要求8的方法，其中所述类黄酮单加氧酶基因启动子包含在SEQIDNO: 13所 述序列上游的序列的至少一部分。13. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含天冬酰胺生物合成基因的有义和 /或反义片段的至少一个拷贝，且被表达，以下调用于生产热加工食品的植物组织中的总天 冬酰胺合成酶mRNA水平。14. 权利要求13的方法，其中所述第一多核苷酸在它的5'-末端可操作地连接到到启 动子上，且在它的3' -末端可操作地连接到启动子上。15. 权利要求2的方法，还包含表达第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成分的至少 一个：（i)选自Rl基因和磷酸化酶L基因的基因的至少一个拷贝，其是有义和/或反义方 向。16. 权利要求15的方法，其中所述第一和第二多核苷酸位于转运DNA内，且包含与SEQ IDN0:23所示序列具有至少70%同一性的序列。17. 权利要求1的方法，其中所述植物是具有块茎的植物。18. 从转基因植物的组织得到的热加工产品，所述组织包含第一多核苷酸，所述多核 苷酸包含参与天冬酰胺生物合成或天冬酰胺代谢的基因的完整或部分序列，其中所述产品 具有比从其它方面相同的非转基因植物的对应组织制备的热加工产品更低的丙烯酰胺浓 度。19. 权利要求18的热加工产品，其中从转基因植物制备的产品具有比从野生型块茎制 备的等同产品改进的感官特征。20. 权利要求18的热加工产品，其中所述转基因植物是具有块茎的植物。21. 权利要求20的热加工产品，其中具有块茎的植物的产品是炸薯条、马铃薯片、炸薯 片、马铃薯或烤马铃薯。22. 权利要求18的热加工产品，其中转基因植物的细胞还包含第二多核苷酸，所述多 核苷酸包含下述成分的至少一个：（i)与Rl基因或基因片段相对应的有义和/或反义序 列，和（ii)与磷酸化酶L基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列。23. 权利要求18的热加工产品，其中所述产品的丙烯酰胺浓度比非转基因植物的热加 工产品中的丙烯酰胺浓度低至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约 40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%。24. -种植物，其在基因组中包含第一多核苷酸，所述多核苷酸包含参与天冬酰胺生物 合成或天冬酰胺代谢的基因的完整或部分序列。25. 权利要求24的植物，其中所述植物是具有块茎的。26. 权利要求25的植物，其中具有块茎的植物是马铃薯植物。27. 权利要求24的植物，还在基因组中包含第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成 分的至少一个：（i)与Rl基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列，和（ii)与磷酸化 酶L基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列。28. 分离的多核苷酸序列，其包含编码能降低植物中的丙烯酰胺水平的多肽的核酸序 列。29. 权利要求28的分离的多核苷酸，其中所述核酸序列选自：SEQIDN0:l、2、9、10、 14、15和28-35,或其变体、片段、互补序列或反向互补序列，且所述核酸编码具有天冬酰胺 酶活性的多肽。30. 权利要求29的分离的多核苷酸，其中所述变体的序列与SEQIDNO: 1、2、17、20、 21中的任一个序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %, 75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61% 或 60 %的序列同一性。31. 从具有降低的天冬酰胺的植物组织生产可食用植物产品的方法，其包含（1)增加 所述植物组织中的天冬酰胺酶水平，或（2)降低所述植物组织中的天冬酰胺合成酶水平。32. 权利要求31的方法，其中增加植物细胞中的天冬酰胺酶水平的步骤包含在该细胞 中表达天冬酰胺酶基因。33. 权利要求31的方法，其中降低植物细胞中的天冬酰胺合成酶水平的步骤包含在该 植物细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸包含（i)Rl基因、（ii)磷酸化酶L基因和（iii)天 冬酰胺合成酶基因的至少一个片段，其是有义和/或反义方向。34. 权利要求31的方法，其中所述可食用植物产品是块茎、炸薯条、马铃薯片、炸薯片、 烤马铃薯或脱水的马铃薯。35. 权利要求31的方法，其中与天冬酰胺酶水平没有增加或天冬酰胺合成酶水平没有 降低的植物产品中的丙烯酰胺水平相比，所述可食用植物产品在被加热后具有更低的丙烯 酰胺水平。36. 生产具有低水平的丙烯酰胺的可食用植物产品的方法，其包含（i)下调天冬酰胺 生物合成基因的表达和/或上调参与天冬酰胺代谢基因的基因的表达，和（ii)下调植物 组织中（a)Rl基因和（b)磷酸化酶L基因中的至少一个基因的表达或活性，所述植物组织 产生用于制备产品的植物、种子或果实。37. 权利要求36的方法，其中下调Rl基因、磷酸化酶L基因和天冬酰胺生物合成基因 的步骤包含：在植物细胞中以有义和/或反义方向表达（i)Rl基因、（ii)磷酸化酶L基因 和（iii)天冬酰胺合成酶基因的至少一个片段。38. 权利要求36的方法，其中所述可食用植物产品是块茎、炸薯条、马铃薯片、炸薯片 或烤马铃薯。39. 权利要求36的方法，其中与非转基因植物的植物产品中的丙烯酰胺水平相比，所 述可食用植物产品在被加热后具有更低的丙烯酰胺水平。40. 生产可食用转基因植物产品的方法，所述产品在被加热后具有比来自非转基因植 物的等同加热产品的丙烯酰胺水平更低的丙烯酰胺水平，该方法包含通过改变参与植物中 天冬酰胺生物合成或天冬酰胺代谢的基因的表达水平，降低转基因植物中的天冬酰胺水 平。41. 权利要求40的方法，其中通过以有义和/或反义方向表达来自天冬酰胺合成酶基 因、硝酸还原酶基因或己糖激酶基因的完整或部分序列的至少一个拷贝，降低天冬酰胺水 平。42. 权利要求41的方法，其中通过在植物中表达来自天冬酰胺酶基因或谷氨酰胺合成 酶基因的完整或功能上有活性的部分序列，降低天冬酰胺水平。43. 在马铃薯块茎中超量表达基因的方法，该方法是通过将该基因可操作地连接到与 SEQIDNO: 13所示序列的至少一部分具有至少70%同一性的序列上。44. 权利要求1的方法，其中降低植物淀粉组织中的天冬酰胺水平。45. 权利要求36的方法，其中所述可食用植物产品具有与未修饰的等同产品相比改善 的感官特征。46. 权利要求45的方法，其中所述可食用植物产品具有选自下述的至少一种改善的感 官特征：外观、风味、香气和质地。
【专利摘要】本发明涉及低丙烯酰胺食品。本发明提供了从植物分离的多核苷酸和多肽序列，降低植物中游离天冬酰胺水平的方法，生产含有降低水平的丙烯酰胺的热加工食品的方法，和通过这些方法得到的植物和食物。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/55, A23L1/015, C12N15/82, A23L1/217
【公开号】CN104894159
【申请号】CN201510301163
【发明人】C.罗门斯
【申请人】J.R.西姆普罗特公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2006年9月19日
【公告号】CA2623266A1, CN101313070A, CN101313070B, DE602006016489D1, EP1974039A2, EP1974039B1, EP2333076A2, EP2333076A3, EP2333076B1, US20070074304, WO2007035752A2, WO2007035752A3