9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或它们的互补序列、反向互补 序列或反向序列的序列的多核苷酸。
[0184] 除了与本发明的多核苷酸序列具有指定的百分比同一性以外，变体多核苷酸优选 地具有与本发明的多核苷酸共有的其它结构和/或功能特征。除了它们的一级结构与本 发明的多核苷酸具有高度的相似性以外，与本发明的多核苷酸具有指定程度的同一性或能 与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸，优选地具有至少一种下述特征：（i)它们含有读码 框或部分读码框，其编码基本上具有与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的功能性质的多 肽；或（ii)它们具有共同的结构域。
[0185] 元件和DNA序列的来源
[0186] 本文所述的任意或所有元件和DNA序列可以是一个或多个植物基因组内源的。因 此，在本发明的一个具体实施方案中，为最终的转运盒选择的所有元件和DNA序列都是待 转化的植物的基因组内源的或天然的。例如，所有序列可以来自马铃薯基因组。或者，一个 或多个元件或DNA序列可以是与待转化的植物物种不同的植物基因组内源的，但是其可以 在任意情况下在宿主植物细胞中起作用。这样的植物包括马铃薯，番茄，和苜蓿植物。本 发明也包括使用一个或多个来自与待转化的植物互交可孕的植物的遗传元件。
[0187] 在这点上，本发明的"植物"包括、但不限于，马铃薯，番茄，鳄梨，苜蓿，甜菜， 木薯，甘薯，大豆，豌豆，菜豆，玉米，小麦，稻，大麦，和高梁。因而，植物可以是单 子叶植物或双子叶植物。"植物"和"植物材料"也包括植物细胞，种子，植物后代，繁殖 体，无论是有性还是无性产生的，和它们中的任一种的子代，例如插条或种子。"植物材料" 可以是指植物细胞，细胞悬浮培养物，愈伤组织，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶， 根，芽，配子体，孢子体，花粉，种子，正在发芽的幼苗，和微孢子。植物可以处于各种 成熟阶段，可以生长在液体或固体培养物中，或罐中的土壤或合适的培养基中、温室或田地 中。导入植物中的先导序列、尾随序列或基因序列的表达可以是暂时的或永久的。
[0188] 核酸构建体
[0189] 本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子和多肽序列的构建体。在一个实施方 案中，本发明的DNA构建体是源自农杆菌的Ti-质粒。
[0190] 在开发本发明的核酸构建体中，构建体或其片段的各种组分通常插入方便的克隆 载体中，例如，能在细菌宿主如大肠杆菌中复制的质粒。存在许多已经在文献中描述的载 体，其中的许多是可商业得到的。每次克隆后，可以分离含有需要的插入片段的克隆载体， 并进行其它操作，例如限制消化，插入新的片段或核苷酸，连接，缺失，突变，切除，等， 以改变需要的序列的组分。完成构建体后，然后可以根据转化宿主细胞的方式，将它转移至 用于其它操作的适当载体中。
[0191] 本发明的重组DNA分子通常包括选择标记，以便可以从未转化的细胞中鉴定和 选择转化的细胞。这样的标记的实例包括、但不限于，新霉素磷酸转移酶（nptll)基因 (Potrykus等人，Mol. Gen.基因 t. 199:183-188 (1985))，它赋予卡那霉素抗性。使用适当 的抗生素例如卡那霉素或G418,可以选择表达nptll基因的细胞。其它常用的选择标记包 括bar基因，它赋予双丙氨磷抗性；突变的EPSP合酶基因（Hinchee等人，Bio/Technology 6:915-922 (1988))，它赋予草甘膦抗性；和突变的乙酰乳酸合酶基因（ALS)，它赋予咪唑啉 酮或磺酰脲抗性（欧洲专利申请154, 204, 1985)。
[0192] 另外，载体可以包括特定宿主细胞的复制起点（复制子）。各种原核复制子是本领 域技术人员众所周知的，并起指导重组分子在原核宿主细胞中的自主复制和维持的作用。
[0193] 本发明也提供了包含本发明的DNA构建体的宿主细胞。如本文使用的，宿主细胞 指最终在其中表达编码产物的细胞。因此，宿主细胞可以是单个细胞、细胞培养物或作为生 物体的一部分的细胞。宿主细胞也可以是胚、胚乳、精子或卵细胞，或受精卵的一部分。
[0194] 因此，本发明也提供了植物或植物细胞，其包含本发明的DNA构建体。优选地，所 述植物是被子植物或裸子植物。本发明的表达构建体可以用于转化许多植物，包括单子叶 植物（例如小麦，草地草，玉米，稻，燕麦，小麦，大麦，高梁，兰花，鸢尾，百合，洋 葱，香蕉，甘蔗，和棕榈），双子叶植物（例如，拟南芥，马铃薯，烟草，番茄，鳄梨，胡 椒，甜菜，绿花椰菜，木薯，甘薯，棉花，猩猩木，豆类，苜蓿，大豆，豌豆，菜豆，黄 瓜，葡萄，芸苔，胡萝卜，草莓，莴苣，橡树，楓树，胡桃，玫瑰，薄荷，南瓜，雏菊，和 仙人掌，橡树，桉树，楓树），和裸子植物（例如，苏格兰松；参见Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595, 1996)，白云杉（Ellis 等人，Biotechnology 11:84-89,1993)，和落 叶松（Huang 等人，In Vitro Cell 27:201-207,1991)。
[0195] 植物转化和再生
[0196] 通过本领域已知的将重组序列导入靶宿主细胞中的标准操作，可以将本发明的 多核苷酸和多肽导入宿主植物细胞中。这些操作包括、但不限于，转染，感染，转化，天 然摄入，电穿孔，生物射弹和农杆菌。将外源基因导入植物中的方法是本领域已知的， 且可以用于将本发明的构建体插入植物宿主中，包括，生物和物理植物转化方法。参见， 例如，Miki 等人，1993, ''Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", 见:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick 和 Thompson, 编.，CRC Press，Inc.，Boca Raton,第67-88页。选择的方法可以随宿主植物而变化，包 括化学转染方法例如磷酸钙，微生物介导的基因转移例如农杆菌（Horsch等人，Science 227:1229-31,1985)，电穿孔，显微注射，和生物射弹。优选的转化方法包括精确育种（参 见：美国专利申请 2003/0221213A1, 2004/0107455A1,和 2005/0229267A1)和精制转化（参 见美国专利申请2005/0034188A1)。
[0197] 因此，本发明也提供了植物或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸或多肽。在一个 实施方案中，所述植物是被子植物或裸子植物。超出植物的普通含义，术语"植物"也意在 指植物的果实、种子、花、球花等。本发明的植物可以是直接转染的，这是指将载体直接导入 植物中，例如通过农杆菌，或所述植物可以是转染的植物的后代。后代也可以通过转染的植 物的无性繁殖来得到。第二代或后代植物可以通过或不通过有性生殖（即受精）来生成。 此外，所述植物可以是配子体（单倍体阶段）或孢子体（二倍体阶段）。
[0198] 在这点上，本发明考虑用一个或多个遗传上源自植物的转化元件转化植物。本发 明考虑转化的"全天然"方案，由此仅植物的天然转化元件通过转化最终整合到目标植物 中。在这方面，本发明包括仅用植物物种天然的遗传转化元件转化特定植物物种。天然方 案也可以指，特定转化元件分离自同一待转化的植物、同一植物物种或与待转化的植物在 性别上互交可孕的植物。
[0199] 另一方面，所述待转化的植物可以用转化盒转化，所述转化盒含有一个或多个源 自不同物种植物的遗传元件和序列。可能希望使用例如切割位点，它在用于转化番茄或胡 椒植物的转化盒或质粒中是马铃薯基因组天然的。
[0200] 但是，本发明不限于，天然的或全天然的方案。本发明的转化盒或质粒也可以包含 来自其它生物体的序列和元件，例如来自细菌物种。
[0201] 下面的实施例作为本发明的特定的和优选的实施方案的代表来予以阐述。这些实 施例不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。应当理解，可以作出许多变化和修改，同 时仍然在本发明的精神和范围内。 实施例
[0202] 实施例1
[0203] 天冬酰胺合成酶基因的下调的表达
[0204] 本实施例证实，参与作物淀粉组织中天冬酰胺生物合成的基因的下调的表达，会 降低这些淀粉组织中天冬酰胺的量，从而降低加热这些淀粉组织得到的食品中丙烯酰胺的 量。
[0205] 在SEQ ID NO: 1中显示了马铃薯天冬酰胺合成酶-I(Astl)基因的序列。在SEQ ID N0:2中显示了马铃薯天冬酰胺合成酶-2(Ast2)基因的部分序列。
[0206] 连接SEQ ID N0:3和4所示的这些基因的片段，以建立SEQ ID N0:5。作为反向重 复序列并被SEQ ID N0:6所示的间隔区隔开，将得到的DNA区段的2个拷贝插入ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶（Agp)和颗粒结合的淀粉合酶（Gbss)基因（分别是SEQ ID NO: 7和8)的趋 同定向的启动子之间。
[0207] 将得到的沉默构建体插入已经含有新霉素磷酸转移酶（nptll)选择标记基因的 表达盒的T-DNA边界之间。
[0208] 如下将命名为pSM1148的含有该T-DNA的二元载体（图1A)导入农杆菌LBA4404。 在有1 μ g载体DNA存在下，在冰上温育感受态LB4404细胞（50 μ L) 5min，在液氮中冷冻 约15s，在37°C温育5min。加入ImL的培养液后，在28°C培养细胞3h，铺板到含有链霉素 (100mg/L)和卡那霉素（100mg/L)的培养液/琼脂上。然后从单个LBA4404菌落的过夜培 养物分离载体DNA，并通过限制分析进行检查，以证实完整质粒DNA的存在。
[0209] 通过使10倍稀释的过夜生长的农杆菌培养物生长5-6小时，在2, 800RPM沉淀15 分钟，用添加了鹿糖（3%，pH 5. 7)的MS液体培养基（Phytotechnology)洗绦，重新悬浮 在相同培养基中直到〇D6(l(lnm为0. 2。混合重新悬浮的细胞，用于感染马铃薯品种"Ranger Russet" 的 0· 4-0. 6mm 结间区段。
[0210] 感染的茎在含68/1琼脂的共培养培养基（1/101^盐，3%蔗糖，？!15.7)上在 Percival生长室（16小时光照）中25°C培养2天，随后转移到含特美汀（150mg/L)和卡 那霉素（lOOmg/L)的愈伤组织诱导培养基（CM,添加了 3%蔗糖3、2. 5mg/L玉米素核苷、 0. lmg/L萘乙酸和6g/L琼脂的MS培养基）上。在CM上培养1个月后，将外植体转移至 含有特美汀和卡那霉素（分别是150和100mg/L)的芽诱导培养基（SM,添加了 3%蔗糖、 2. 5mg/L玉米素核苷、0. 3mg/L赤霉酸GA3和6g/L琼脂的MS培养基），直到发芽。将在再生 期末期发出的芽转移至含有3%蔗糖、6g/L琼脂和特美汀（150mg/L)的MS培养基。将转基 因植物转移至土壤，置于温室中。
[0211] 3 个月后，收获块莖，根据 Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL (2002)，第 17 版，AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA Official Method 982. 30,分析天冬酰胺水平。该分析证实，26株pSM1148植物中的17株仅含有对 照植物中存在的约25% -50%的天冬酰胺（表1)。
[0212] 将来自一些低天冬酰胺植物的块茎切片，漂白，平常油煎（par-fried)，并精制 油煎，生产炸薯条。将这些炸薯条在液氮中粉碎成细粉，在干冰上运送到Covance实验 室。在Covance，通过进行液相色谱/质谱/质谱（LC/MS/MS)(美国食品和药品管理局， 植物以及乳制品和饮料的食品安全中心和应用营养办公室，"食品中丙烯酰胺的检测和定 量"，2002)，测定丙烯酰胺水平。表2证实，来自低天冬酰胺pSM48植物的薯条积累的丙烯 酰胺少于在对照薯条中生成的丙烯酰胺的约1/3。
[0213] 作为使用Agp和Gbss启动子作为调节元件的一个替代方案，也可以使用2个Gbss 启动子。将含有反向重复序列的构建体导入T-DNA边界之间，以生成二元载体pSIM1151，所 述反向重复序列包含插入2个Gbss启动子之间的Astl和Ast2基因片段（图1B)。该载体 用于以与关于PSM1148所述类似的方式生产转基因马铃薯系。此外，Ast基因-衍生的序 列可以插入启动子和终止子之间。
[0214] 对于任意的Ast基因，可能存在具有高度序列相似性的其它序列。可以使用这样 的同源序列来生产沉默构建体。例如，番茄Ast基因的片段可以用于沉默马铃薯中的同源 Ast基因 〇
[0215] 鉴定植物衍生的Ast基因之后，为该基因的PCR-扩增设计基因特异性的引物。根 据本领域已知的方法，进行PCR扩增，然后将PCR扩增的天冬酰胺酶基因克隆进克隆载体 中。
[0216] 可以通过检索数据库来识别Ast基因，或从植物DNA分离。来自马铃薯以外的作 物的Ast基因的一个实例是SEQ ID NO: 34和35所示的来自小麦的Ast基因。同时沉默小 麦谷粒中的这些基因，可以降低面粉中的天冬酰胺水平，从而降低例如面包、饼干、小甜饼 或薄脆饼中的丙烯酰胺水平。
[0217] 除了使用Ast基因片段来生产沉默构建体以外，也可以使用从Ast基因的启动子 得到的片段。通过使用反向PCR等方法，可以分离这样的启动子，然后可以将特定150-600 个碱基对的启动子片段的2个拷贝作为反向重复序列插入启动子和终止子之间，或2个趋 同方向的启动子之间（参见：R〇mmens等人，世界专利申请2006/036739 A2,它在本文中 引作参考）。
[0218] 实施例2
[0219] 天冬酰胺酶基因的超量表达
[0220] 本实施例证实，参与作物淀粉组织中天冬酰胺代谢的基因的超量表达，会降低这 些淀粉组织中天冬酰胺的量，从而降低加热这些淀粉组织得到的食物中丙烯酰胺的量。
[0221] 在SEQ ID N0:9中显示了来自马铃薯品种Ranger Russet的马铃薯天冬酰胺酶 (Asgl)基因的序列。分别在SEQ ID NO: 10和11中显示了对应的读码框和预测的氨基酸序 列。含有插入在Agp启动子和Ubi3终止子之间的Asgl基因的二元载体（SEQ ID N0:12) 命名为pSM658(图1C)。
[0222] 通过应用定量实时反转录酶PCR，测定块茎中Asgl基因的表达水平。表3证实，25 株PSM658植物中的18株的块茎超量表达Asgl基因约2至20倍。这些块茎用于生产炸 薯条。化学分析证实，2个转基因系的炸薯条含有降低水平的丙烯酰胺（表4)。
[0223] 也可以使用其它块茎特异性启动子来驱动Asgl基因的表达。质粒pSM757含有 可操作地连接到Asgl基因上的Gbss启动子。用该质粒的转运DNA转化马铃薯，会生成卡 那霉素抗性的、超量表达Asgl基因的植物。可以用于驱动马铃薯块茎中的天冬酰胺酶表达 的其它启动子，可以选自马铃薯块茎特异性蛋白启动子，冷诱导型启动子，和类黄酮化合 物_3'_单加氧酶（Fmo)启动子。一个Fmo启动子如SEQ ID NO: 13所示。该启动子在半成 熟的和成熟的块茎中是有活性的，但是在小块茎中是无活性的。
[0224] 除了使用Asgl以外，也可以采用其它天冬酰胺酶基因 。SEQ ID N0:14显示了替 代性马铃薯天冬酰胺酶Asg2基因的cDNA序列。天冬酰胺酶基因的其它实例包括大肠杆菌 (登记号Z1051m ;SEQIDN0:31)、农杆菌（登记号Atu3044;SEQIDN0:32)、大麦（登记号 AF308474;SEQ ID N0:33)的天冬酰胺酶基因，和编码具有基序pfam01112. 12的蛋白的任 意基因（Marchler-Bauer 等人，Nucleic Acids Res 33, D192-6, 2005) 〇
[0225] 在SEQ ID NO: 15中显示了小麦的天冬酰胺酶基因的序列。在SEQ ID NO: 16中描 述了预测的氨基酸序列。
[0226] 对于任意的天冬酰胺酶基因，可能存在具有高度序列相似性的其它天冬酰胺酶序 列。例如，通过检索数据库，例如由NCBI维护的那些，可以鉴别植物衍生的天冬酰胺酶基 因。
[0227] 鉴别植物衍生的天冬酰胺酶基因之后，为天冬酰胺酶基因的PCR-扩增设计基因 特异性的引物。根据本领域已知的方法，进行PCR扩增，然后将PCR扩增的天冬酰胺酶基因 克隆进克隆载体中。
[0228] 将天冬酰胺酶可操作地连接到种子特异性的启动子上，例如SEQ ID NO: 17所述的 小麦嗓呤二氢吲噪（puroindoline)基因启动子。使用生产低天冬酰胺小麦的常规转化方 法，导入包含得到的表达盒的转运DNA。从小麦种子得到的面粉会在加热过程中积累更少的 丙烯酰胺。
[0229] 实施例3
[0230] 谷氨酰胺合成酶的超量表达
[0231] 谷氨酰胺合成酶基因的超量表达会导致降低水平的天冬酰胺。可以将编码具有谷 氨酰胺合成酶活性的蛋白的任意序列可操作地连接到在目标植物器官（例如马铃薯块茎） 中表达的启动子上。马铃薯含有3个相关的谷氨酰胺合成酶基因，如SEQ ID NO. :28-30所 示。包含每个这样的基因的一个片段的DNA区段可以用于有效地下调谷氨酰胺合成酶活 性。为此目的，可以将该区段的至少一个拷贝插入2个趋同启动子之间，或启动子和终止子 之间。使用任意的转化方法，可以将得到的表达盒导入目标植物。然后可以选择生产低天 冬酰胺植物器官的转基因植物。这些植物器官的热加工会提供含有比从对应器官得到的产 品更低的丙烯酰胺的产物。例如，加工过的转基因块茎会产生这样的炸薯条，其含有比从 未转化的块莖得到的炸薯条更低的丙稀酰胺水平。Harrison和合作者（Plant Physiology 133:252-262, 2003)已经描述了谷氨酰胺合成酶超量表达对天冬酰胺水平的影响。但是，这 些作者没有预见到降低的天冬酰胺水平对强烈减少的热诱导的丙烯酰胺积累的影响。
[0232] 类似地，可以下调显示出硝酸还原酶活性的内源基因的表达。为此目的，可以表达 该基因的一部分或硝酸还原酶基因的启动子的至少一个拷贝。可以筛选转基因植物的硝 酸还原酶基因表达水平，然后可以筛选表现出降低水平的系的降低的天冬酰胺水平。也可 以沉默己糖激酶基因并增加天冬氨酸水平，同时降低天冬酰胺水平。以前已经描述了硝酸 还原酶和己糖激酶基因的超量表达与增加的天冬酰胺水平之间的关联（Roland等人，Annu Rev Plant Biol 57:675-709, 2006 ;Szopa，Biochem Soc Trans 30:405-410, 2002)。但是， 作者没有预见到最终降低食物中的丙烯酰胺水平的相应方案。
[0233] 显然，存在通过改变直接或间接参与天冬酰胺的合成或代谢的基因的表达，修饰 植物中的天冬酰胺水平的其它策略。我们的结果暗示着，任一种这样的方法都可以用于生 产低丙烯酰胺食物。
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