10mg/ml BSA的T6液滴内，用口吸管轻轻吹打，使精子团分散开，于37°C、5% 0)2及饱和湿 度的〇)2培养箱内中孵育1. 5小时左右，进行获能；在此期间用细胞计数板检测精子密度； 再将hCG后12小时或IVM后14小时的卵母细胞在受精液（T6+20mg/mlBSA)中洗3次，移入 已经平衡过夜的受精滴（20枚/40 μ 1)中，加入适量体积的获能精子，使精子密度在I X IO6左右。培养6小时后，用无糖CZB液洗去卵母细胞周围附着精子，选取含两原核和第二极体 的受精卵，置于无糖CZB中培养；
[0032] 将种公牛冷冻细管精液（购自内蒙古家畜改良站）在37°C水浴中解冻，用含有 IOmM咖啡因的BO液离心洗涤两次，第二次离心之后，静置2~3min，小心吸取上浮精子，加 入同等体积的受精B液（B0+3mg/mLBSA+8 μ Ι/ml肝素）制成精子悬浮液，光镜下细胞计数， 使终浓度达到X IOfVml。用精子悬浮液做受精小滴（100 μ 1)，每小滴放入15枚成熟培养后 的卵母细胞；受精6~7h后去除卵丘，将受精卵转入发育培养液；发育培养液采用S0F+6% BSA，每40 μ 1发育培养液小滴放入15~20枚受精卵进行培养。
[0033] 实施例2
[0034] 卵母细胞体外成熟培养：
[0035] 一、配制卵母细胞体外成熟培养液：准确称取维生素 B12IOOmg,先用25ml的MEM 培养液（购自GIBCO公司）溶解，然后向培养液中加入5ml胎牛血清和5000IU青霉素及 5000 μ g链霉素，轻微搅拌混匀，再加入FSH 2. 5IU、LH 2. 5IU、17 β-雌二醇50 μ g、丙酮酸 钠 I. 21mg和EGF 500ng，轻轻混匀，静置2~3小时后，用0. 22 μ m的过滤器抽滤消毒后，分 装到I. 5ml离心管中，4°C下储存，备用。
[0036] 二、体外培养：将小鼠 GV期卵母细胞放入37°C预热2小时的卵母细胞体外成熟培 养液中，然后置于CO2体积浓度为5%的环境内成熟培养24小时；将牛GV期卵母细胞放入 38. 5°C预热2小时的卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于CO2体积浓度为5%的环境内成 熟培养24小时。
[0037] 三、体外受精或孤雌激活，胚胎继续培养7天，培养48小时记录2-细胞胚胎及 4-细胞胚胎比率：
[0038] 其中，孤雌激活：小鼠卵母细胞采用SrCl2激活，体外成熟卵母细胞先在含IOmM SrClJP CB的无钙CZB中培养2. 5h，再在含有CB的含钙CZB中培养3. 5h，之后转移至CZB 中继续培养，培养48小时至4-细胞胚胎期转移至含糖CZB中培养至囊胚；
[0039] 牛卵母细胞采用inomycin激活，牛GV期卵母细胞先在含5 μ M inomycin的CRl 中激活5分钟，再在含6-DMAP的CRl的培养液中继续培养4小时，之后转移至CRl中培养， 培养48小时发育至4-细胞胚胎期再换到CRl中继续培养至囊胚。
[0040] 体外受精：选取性成熟（10~12周龄）昆明白雄鼠，已通过交配实验证明其有 受精能力，颈椎脱白法处死，从附睾尾和输精管收集精子，将收集的精子团块置入Iml含 10mg/ml BSA的T6液滴内，用口吸管轻轻吹打，使精子团分散开，于37°C、5% 0)2及饱和湿 度的〇)2培养箱内中孵育1. 5小时左右，进行获能；在此期间用细胞计数板检测精子密度； 再将IVM后14小时的卵母细胞在受精液（T6+20mg/mlBSA)中洗3次，移入已经平衡过夜的 受精滴（20枚/40 μ 1)中，加入适量体积的获能精子，使精子密度在IX IO6左右。培养6小 时后，用CZB液洗去卵母细胞周围附着精子，选取含两原核和第二极体的受精卵，置于CZB 中培养；
[0041] 将种公牛冷冻细管精液在37°C水浴中解冻，用含有IOmM咖啡因的BO液离心洗 涤两次，第二次离心之后，静置2~3min，小心吸取上浮精子，加入同等体积的受精B液 (B0+3mg/mLBSA+8 μ Ι/ml肝素）制成精子悬浮液，光镜下细胞计数，使终浓度达到X IO6/ ml。用精子悬浮液做受精小滴（100 μ 1)，每小滴放入15枚成熟培养后的卵母细胞；受精 6~7h后去除卵丘，将受精卵转入发育培养液；发育培养液采用S0F+6% BSA，每40 μ 1发 育培养液小滴放入15~20枚受精卵进行培养。
[0042] 实施例3
[0043] 对照试验组
[0044] 配制2组对照培养液，对应与实施例1的区别仅在于培养液中不含有维生素 B12, 其他的均与实施例1和2相同。
[0045] 实验数据如表1和表2所示。
[0046] 表 1
[0047]
[0050] 结果证实，本发明卵母细胞体外成熟培养液体外成熟培养小鼠和牛卵母细胞可有 效提高受精或孤雌激活后的早期胚胎发育率。
【主权项】
1. 一种卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于卵母细胞体外成熟培养液由卵母细胞常 规培养液和维生素B12、胎牛血清、FSH、LH、17 0 -雌二醇、丙酮酸钠、EGF、青霉素及硫酸链霉 素组成；卵母细胞体外成熟培养液中维生素B12的浓度为2mg/ml、血清的浓度为0.lml/ml、 卵泡刺激素的浓度为〇. 〇5IU/ml、黄体生成素的浓度为0. 05IU/ml、17 0 -雌二醇的浓度为 IUg/ml、丙酮酸钠的浓度为24. 2mg/L、表皮生长因子的浓度为10ng/ml、青霉素的浓度为 100IU/ml、硫酸链霉素的浓度为100yg/ml。2. 根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于卵母细胞常规培养液 为DMEM培养液、TCM199培养液或MEM培养液。3. 根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于血清为小牛血清、胎 牛血清或新生牛血清。4. 利用权利要求1卵母细胞体外成熟培养液培养卵母细胞的方法，其特征在于卵母细 胞用卵母细胞体外成熟培养液按以下步骤培养： 将卵母细胞放入预热的卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于CO2体积浓度为5%的环 境内成熟培养20~24小时，即获得成熟的卵母细胞。5. 根据权利要求4所述的卵母细胞体外成熟培养液培养卵母细胞的方法，其特征在于 卵母细胞为GV期卵母细胞。6. 根据权利要求4所述的卵母细胞体外成熟培养液培养卵母细胞的方法，其特征在于 卵母细胞体外成熟培养液预热1~3小时。7. 根据权利要求4或6所述的卵母细胞体外成熟培养液培养卵母细胞的方法，其特征 在于卵母细胞体外成熟培养液置于35~40°C的环境中预热。8. 根据权利要求7所述的卵母细胞体外成熟培养液培养卵母细胞的方法，其特征在于 培养牛卵母细胞，卵母细胞体外成熟培养液置于38. 5°C的环境中预热和培养。9. 根据权利要求7所述的卵母细胞体外成熟培养液培养卵母细胞的方法，其特征在于 培养小鼠卵母细胞，卵母细胞体外成熟培养液置于37°C的环境中预热和培养。10. 根据权利要求4所述的卵母细胞体外成熟培养液培养卵母细胞的方法，其特征在 于3y1的卵母细胞体外成熟培养液中放入1枚卵母细胞。
【专利摘要】一种卵母细胞体外成熟培养液及利用其培养卵母细胞的方法，涉及一种卵母细胞培养液及利用其培养卵母细胞的方法。解决了现有卵母细胞体外培养发育能力低的问题。卵母细胞体外成熟培养液由卵母细胞常规培养液和维生素B12、胎牛血清、FSH、LH、17β-雌二醇、丙酮酸钠、EGF、青霉素及硫酸链霉素组成。将卵母细胞放入预热的卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于CO2体积浓度为5％的环境内成熟培养20～24小时，即获得成熟的卵母细胞。本发明卵母细胞体外成熟培养液能够减少外界环境带来的应激损伤，促进卵母细胞的细胞质成熟，提高了体外成熟的卵母细胞孤雌激活和受精后的胚胎发育能力。
【IPC分类】C12N5/075
【公开号】CN104928236
【申请号】CN201510389988
【发明人】曹新燕, 许保增, 李晓霞, 刁云飞, 王世勇, 薛海龙, 赵伟刚, 魏海军, 赵蒙, 徐超, 杨镒峰, 鞠妍, 邢明杰
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月6日