cv. Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻OsStil基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0041] 本实验例中以水稻双元表达载体PCAMBIA1391 (来自于CAMBIA，公开使用载体， 安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标 基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID N〇:3)5'端带Hindlll，酶切位点 (AAGCTT)，反向引物（SEQ ID No:4) 5'端带EcoRI，酶切位点（GAATTC)，引物序列如下：
[0042] 正向引物：AAGCTTTCGGGTGAAATGCTACAATGGT HindII I
[0043] 反向引物：GAATTCATTCACTTGGTTTTTGCCTGCT EcoRI
[0044] 由深圳华大基因公司合成。
[0045] 步骤2、启动子OsStil的获得
[0046] 以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsSti 1，按常 规PCR体系，采用如下扩增程序：
[0047] 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，循环 35 次；最 后 72°C延伸 lOmin。
[0048] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1906bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体 (购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue 感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌 落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切验证， 如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所 要获得的启动子OsStil，其核酸序列如SEQ ID N〇:l所示。申请人也以其他引物进行了类 似实验，这里不再详述，证实采用其他引物也可以获得本发明的启动子，并且实现启动子功 能，从而证明SEQ ID No :2中的序列为本发明的核心序列。
[0049] 棺物表汰裁体的构律和农杆菌的转化
[0050] 从上面"启动子OsStil的获得"过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII 和EcoRI酶切，回收启动子OsStil片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进 行线性化处理、回收PCAMBIA1391，将上述的OsStil片段和pCAMBIA1391片段用T4连 接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子OsStil与Gus基因融合的植物表达载 体pCAMBIA1391_0sStil，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水 稻组保存）。本领域技术人员应该理解，根癌农杆菌还可以采用其它形式的菌株，并不必须 采用安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心所保藏的菌株。
[0051] 利用启动子OsStil驱动Gus报告基闵在水稻中表汰
[0052] 步骤1 :农杆菌介导的水稻遗传转化
[0053] 将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有1滴 Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4% )溶液浸泡种子40min (150r/min)。倒 掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀 沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与 胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于 农杆菌的转化。
[0054] 采用上述"植物表达载体的构建和农杆菌的转化"过程中转入了重组表达载体 的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得OsStil: : gus转基因水稻植株，该遗传转 化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan (Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J]. Plant Cell Report, 2012. D0I10. 1007/s00299-01201275-3.) 等提出的方法。
[0055] 步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色
[0056] 将转化OsStil启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、花等器官分别进行 ⑶S染色：将各组织分别浸于⑶S染色液中，37°C，过夜24小时，75%乙醇脱色，将组织中的 叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。染色结果如图3所示，在 根、茎、叶片、叶鞘以及子房中，基本没有检测到GUS基因的表达，而在转基因水稻雌蕊的柱 头中，显现出肉眼可明显观测到的很强的蓝色。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株 的柱头中指导其下游的GUS蛋白表达，这种表达具有柱头组织表达特异性。
[0057] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【主权项】
1. 一种水稻柱头特异强启动子OsStil，其特征在于，包含： (a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；或者 (b) 在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者 (c) 在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者 (d) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具有启动 子功能的核苷酸序列；或者 (e) 与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有启动子功能的 核苷酸序列；或者 (f) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷 酸序列； (g) SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列；或者 (h) 与SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的且具有启动子功能的 核苷酸序列；或者 (i) 在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者 (j) 在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者 (k) 在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具有启 动子功能的核苷酸序列；或者 (l) 在严格条件下与SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷 酸序列。2. 根据权利要求1所述的水稻柱头特异强启动子OsStil，其特征在于，所述水稻柱头 特异强启动子OsStil由（a)_ (1)所述的启动子构成。3. -组用于扩增权利要求1所述的水稻柱头特异强启动子OsStil的全长或其任意片 段的引物对。4. 一种含有权利要求1所述的水稻柱头特异强启动子OsStil的重组载体。5. -种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体 PCAMBIA1391的多克隆位点插入权利要求1所述的水稻柱头特异强启动子OsStil得到的重 组质粒，在所述重组表达载体中，所述水稻柱头特异强启动子OsStil连接于载体中待表达 的基因序列的上游。6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达基因为对水稻柱头 性状具有改善功能的基因。7. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的水稻柱头特异强启 动子 OsStil。8. -种根据权利要求1中所述的水稻柱头特异强启动子OsStil在培育转基因植物中 的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中任意一项所述的水稻柱头特异强 启动子OsStil连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组 表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植 物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻柱头特异强启动子OsSti1及其应用，本发明的启动子以序列表中SEQ ID No：1和2中的序列为基础序列，并且在此基础上进行了扩展。本发明包含了上述两个序列的各种变体，尤其是各种变体中具有启动子功能的序列。本发明还提供了含有该水稻柱头特异强启动子OsSti1的表达盒和植物表达载体并将其应用于植物基因工程中。此外，本发明还提供了一组专门用于从日本晴水稻中扩增本发明启动子的引物对。本发明的启动子对于水稻生殖相关分子机制的研究具有重要的理论及实际意义。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/113, A01H5/00, C12N15/11
【公开号】CN104946650
【申请号】CN201510398952
【发明人】魏鹏程, 杨剑波, 李莉, 秦瑞英, 李 浩, 李娟 , 杨亚春, 许蓉芳, 马卉
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月7日