= 1. 00]， J入1[PP = 1. 00])的重排的特征的分析显示，这些抗体是称作CH103克隆性世系的单克隆 世系代表（图2,表2)。
[0079] 使用如前所述的地理上和遗传多样的Env假病毒（其代表主要循环遗传亚 型和循环重组形式）的（Wu et al, Science 329:856-861(2010)，（Seaman et al，J. Virol. 84:1439-1452(2010)) 196 板（panel)进行中和分析显示，CH103 中和 55% 的病毒 分离物，敏感分离物中的IC5Q的几何平均值为4.54 μg/ml (图1C，表3)。ELISA交叉竞 争分析显示结合于gpl20的CH103与已知的⑶4bs配体（例如mAb VRC01和嵌合蛋白 CD4-Ig)竞争（图1D);与RSC3Env结合的CH103也通过gpl20与具有已知能降低大部分 CD4bs mAbs结合的P363N和A371I突变体的结合实质上减少（图9) (Wu et al, Science 329:856-861 (2010)，Lynch et al，J. Virol. 86:7588-7595(2012))。
[0080] CH103BnAb世系的分子表征
[0081] RSC3探针通过单细胞流式筛选分离CH103、CH104、CH105和CH106BnAbs。 通过焦磷酸测序传播后66和140周获得的PBMC DNA(Liao et al，J.Exp. Med. 208:2237-2249 (2011)，Boyd et al，Sci.Transl. Med. 1:12ra23 (2009))，以及传播后 6、14、53、92周获得的〇0嫩抗体转录本（1116七&1，5(^61?^ 333:1593-1602(2011))鉴 定的VHDJ#PV 序列丰富了 CH103克隆性世系。从抗体基因转录本的焦磷酸测序，发现 了 457个独特的重链和171个独特的轻链克隆成员（图2A，2B)。为了综合研宄，从焦磷 酸测序回收的VHDJ H序列（1AH92U、1AZCET和1A102R)和推断的中间体（I)抗体（11-14、 17、18)的 VHDJH基因（Haynes et al，Nat. Biotechnol. 30:423-433 (2012)，Ma et al5PLoS Pathog. 7:e100 2200(2001)), Liao et al, J. Exp. Med. 208:2237-2249 (2011)) (Kepler, TB, Submitted，2012)中重建了代表性的14个成员的BnAb通路，所述VHDJH基因是成对的，并 用基于￥义与UCA或成熟抗体的遗传距离的UCA或者I2V 行表达（图2C，表2)。成 熟CH103、CH104和CH106抗体与其天然VJJS对。从RSC3记忆B细胞筛选分离的CH105 天然V HDHJH与12的V 对。
[0082]虽然已公开的 CD4bs BnAbs VRC01、CH31 和 NIH45-46VhDJh的 VhDJh 突变频率是 30-36 %(Wu et al, Science 329:856-861 (2010), Wu et al, Science333:1593-1602(2011), Zhou et al,Science 329:811-817 (2010), Scheid et al,Science333:1633-1637(2011), (Bonsignori et al, J, Virol. 86:4688-4692(2012)), 但是 CH103 世系 CH103、CH104、CH105 和 CH106VHDjj9频率是 13-17% (图 2C)。此外，CH103 克隆性世系中的抗体并不包括在BnAbs (1-3)的VRC01类中常见的大的（>3nt)插入或缺失 突变，除了包括3aa LCDR1缺失的CH103的VA之外。
[0083] 已提出，难以诱导⑶4bsBnAbs的一个原因是异源HIV-lEnvs并不结合其 UCAs(Zhouetal,Science329:811-817 (2010),Xiaoetal,Biochem.Biophys.Res.Com mun. 390:404-409(2009))，Scheidetal,Science333:1633-1637(2011))。呈现的问题 在于，相比于异源Env，CH505T/FEnv(用于CH103BnAb世系的初始驱动抗原）是否将优 先结合早期的CH103克隆性世系成员和UCA。实际上，异源gpl20T/FEnv(B. 63521)并不 结合CH103UCA(图2D)，但结合于克隆性世系的后面的成员。在CH103世系的体细胞进化 期间，对该异源Env的亲和力增加了 4个数量级，在成熟CH103-CH106mAbs中最大Kd值为 2.4-7.011]\1(图20)。〇1103此4 11^13也并不结合其他异源17^￡1^4￡.427299、8.9021 和 C. 1086(表4)，证明了没有结合CD4bsUCA的异源Env。此外，gpl20EnvRSC3蛋白也并不 结合CH103UCA和克隆性世系的早期的成员（图9A)，并且没有发现与RSC3突变蛋白（已知 其干扰⑶4bsBnAb的结合）结合（图9B)。
[0084] 与异源Env相反，CH505T/F Env gpl40与所有候选UCA (表5)结合良好，并具有 最高Kd= 37. 5的UCA亲和力。此外，CH505T/F Env gpl40被CH103克隆性世系的所有成 员识别（图2D)。虽然对异源T/F Env B. 63521的亲和力随着CH103世系成熟增加超过4 个数量级，但是对CH505T/F Env的亲和力增加不超过10倍（图2D)。为了直接证明Env 逃逸CH103世系成员，在感染后30、53和78周分离的自体同源重组gpl40Env被表达，并与 CH505T/F Env比较同CH103克隆性世系的BnAb臂的结合能力（表6,图10)。逃逸突变株 Env可以分离，其与CH103克隆性世系成员有逐渐减小地反应性。从第30、53和78周分离 的Env失去UCA反应性，并仅结合中间抗体3、2和1，以及BnAbs CH103、CH104、CH105和 CH106(表6)。此外，第78周病毒中的两株Env逃逸突变株也失去与所有中间抗体或者所 有世系成员的强反应性（表6)。
[0085] 为了对来自初始世代的CH103克隆性世变异体诱导的中和的广谱性和效力的进 行定量，使用了来自5个时间点（传播后第6、14、53、92和144周）的抗体cDNA转录本进 行焦磷酸测序（表7)。发现了与CH103克隆性世系紧密相关并且可能是CH103克隆性世 系成员的两种^^^^链（图2A，表7)。此外，当以全长IgGl骨架重建并用UCA V 表达时， 这些VHDJH中的一个在11 y g/ml的端点滴度与CH505T/F Env gpl40有微弱结合（图2A)。 这些重建的抗体伴有传播后14周的CH505血浆自体同源中和活性（图8)。结合CH505T/F Env的抗体早在传播后4周就呈现在血浆中（数据未显示）。CH103世系V HDJ#P V Jj!列 在第53周达到顶峰，分别具有230个和83个独特的转录本。VHDJH克隆成员在第144周降 低至46个，VJt成员在第144周降低至76个。
[0086] 多反应性是BnAbs的常见特征，这表明一些BnAbs的产生可能通过耐受机制控 制（Haynes et al, Science 308:1906-1908 (2005)，Mouquet et al，Nature467:591-595 (2010)，Haynes et al, Hum. Antibodies 14:59-67(2005))。相反地，多反应性可在 B 细 胞的体细胞进化期间在生发中心（germinal center)中产生以作为B细胞发育的正常 组分（Wardemann et al, Science 301:1374-1377(2003))。评估 CH103 克隆性世系的多 反应性，通过HEp-2细胞反应性和对自身抗原组的结合来测得（Haynes et al, Science 308:1906-1908 (2005))。尽管CH103克隆性世系的较早成员通过这些测试并不是多反应 性的，但是多反应性的获得是与通过中间抗体12、II和克隆成员CH103、CH104和CH106的 BnAb活性相协调的（图11A、11B)。BnAbs CH106和中间抗体II也在蛋白测验中显示出多 反应性，其对几种人类自身抗原（包括延长因子-2激酶和泛素-蛋白质连接酶E3A)具有 特异性的反应性（图11C和11D)。
[0087] 具有HIV_lgpl20的复合体中的CH103结构
[0088] Fab CH103和HIV的ZM 176. 66株之间的复合体的晶体以3.丨5A的分辨率衍射，分 子置换法鉴别出对于Fab CH103和对于gpl20的外部结构域的溶液（图3A)。CH103-gpl20 晶体晶格（图12)的检查显示，gpl20内部结构域的缺失有可能与延伸的gpl20核心到 外部结构域片段的蛋白水解的降解有关。优化至Rh#/RSeW为19. 1%/25.3% (表8) 证实了缺少gpl20残基N末端至残基Val 255gpl2(l或C末端至Gly472 gpl2CI(gpl20残基根 据标准HXB2命名法计数）的电子密度，并且对于残基301-324 gpl2Q(V3)、398-411gpl2Q(V4) 和421-439gpl2CI(f3 20-21)的残基，没有发现电子密度。在CH103的复合体中的gpl20的 有序部分（gpl20残基根据标准HXB2命名法计数）与被抗体VRC01结合的完全延伸的 核心gpl20(Zhou et al，Science 329:811-817(2010))的重叠显示了高度相似的结构 (C a -rmsd 1.16A )(图3B)。尽管缺少核心gpl20的部分，但是整个CH103表位似乎存在于 对于实验观察到的gpl20外部结构域的电子密度中。
[0089] 被CH103结合的表面形成了狭长的斑块，其尺寸为约40* 10,4,其延伸穿过gpl20外 部结构域与CD4接触的初始位点（图3C)。被CH103识别的gpl20表面与CD4接触的初始 位点很好地关联；在被CH103接触的残基中，仅八个没被预测为与CD4相互作用。CH103与 这些残基通过侧链在D环中与5^256^%接触，主链和侧链在⑶4结合环中与Hi s364 gpl2Q和 1^11369^^。接触，以及主链和侧链在V5环中与Asn463gpl2Q和Asp464 gpl2Q接触来相互作用（图 3D)。显著的，残基463是ZM176. 66株以及自体同源CH505病毒中的N-连接糖基化的预测 位点，但是没有观察到对于N-连接聚糖的电子密度。总体上，在观察到的mAb CH103接触 的gpl20上的22个残基中，预计14个与⑶4相互作用（这些残基中的16个与抗体VRC01 相互作用），这提供了 CH103对于CD4表位特异性和其广谱识别的结构基础（表9)。
[0090] 在抗体重链上的残基1_215H。与l-209m显示良好限定的骨架密度。总体上，CH103 利用⑶R H3显性模式的相互作用，尽管所有六个互补决定区（⑶R)与gpl20以及轻链框架 区域3 (FWR3)相互作用（图4A、B，表10和11)。重要的是要注意约40%的抗体接触表面在 两个区域（在⑶R H2和⑶R Ll、L2和FWR3)被体细胞突变改变。尤其是，残基56hc、5〇w 5、和66 u被体细胞突变改变以与gpl20的CD4结合环、D环和V5环形成氢键。但是，在 CH103种系中，88%的CH103VhDJ#P44%的V A J A接触区域氨基酸未突变，这潜在提供了 T/F Env强力结合CH103UCA的一种解释（图4C、4D和表12)。
[0091] 传播/首建Env序列的进化追踪BnAb活性的获得
[0092]使用单基因组扩增和测序（Keele et al，Proc. Natl. Acad. Sci.USA105:7552-755 7 (2008) )，CH505env基因的进化从直到传播后160周的T/F病毒纵向地追踪（图5、图12)。 在感染后4周发现在Env中的最早的频发突变N279K(HIV-1HXB2编号），并在Env D环中 一个CH103接触残基中。到第14周，D环中出现另外的突变，然后在第20周在VI中出现 突变和插入。到第30周，V5环中的插入和突变开始累积（图5)。因此，从感染的3个月内 开始，T/F病毒开始在关键CD4接触区域多样化（图13、14)。D环和V5突变直接在CH103/ Env接触残基中或邻近CH103/Env接触残基。虽然VI区域并不包括在CH103-Env共晶中， 观察到的VlCH505Env突变与对于⑶4和VRC01的接触残基相邻，因此其有可能相关。也有 可能早期VI插入（图5)通过抑制到达三聚体中的CD4bs来选择，或者其响应于早期T细 胞压力而产生。到第78周，出现CD4结合环突变。一旦能直接影响CH103世系结合的区域 开始进化（环D、V5、CD4结合环和有可能地VI)，它们就在整个研宄期间处于持续的正向选 择压力之下（图5、图13、14,表13)。
[0093] 大量样品内病毒的变异性明显在可能影响CH103世系抗体结合的Env区域中，在 这些区域内的多样化先于中和宽度。在病毒进化早期（传播后4-22周）的增大的多样化 符合自身自体同源NAbs发展，与自体同源Nab逃逸突变相一致。在CH505Env接触区域中 之后在发生Nab宽度之前，从41-78周立即积累突变（图5,图13、14)。到第30-53周，大 量样品内多样化产生于CH103接触残基中和其周围的点突变，和在VI和V5中的多个插入 和缺失（图14)。强的选择性压力似乎在第30和53周参与进来，也许这是因为自体同源中 和逃逸，以及此时间点之后发生中和宽度（图5、13、14)。重要的是，由于30周和53周之间 的显而易见的强的正向选择性压力，在病毒种群中存在大的漂移（这在系统发育树中显而 易见），以致于仅仅是携带有相对于T/F的多个突变（尤其在CH103接触区域）的病毒才延 续到第30周后。随后是从第53周开始，在关键表位区域中极端和增多的时间点内多样化 (图14)。具有中和宽度的抗体的出现在此时间发生（图8,表1)。因此，在高度多样形式 的CH103表位接触区域存在的条件下，血浆宽度进化了（图5,图8)。
[0094] 为了评估和比较对在CH103和CD4接触的区域中的氨基酸的免疫压力，比较在感 染的第一年期间病人CH505的进化中的T/F序列中，和随着时间的流逝在被追踪的16个其 他急性感染的病人中的突变的频率（图15)。CH505病毒种群中的突变的累积在可能与从 CH103世系逃逸相关的区域集中（图15A)，在CH505中比在其他主体中，这些区域的多样化 在感染的最初6个月期间更加广泛得多（图15B)。但是，感染一年后，来自其他主体的病毒 也开始在这些区域获得突变。因此，在CH103接触区域的早期和持续的突变积累可能强化 了在病人CH505中的中和抗体宽度的早期发生。
[0095] 自体同源和异源病毒以及CH103世系的中和
[0096] 自体同源BnAb的活性被限制在CH103世系的BnAb臂的较后的成员（13和更后面 的），这通过它们的携带等级2的Envs A. Q842和B. BG1168的假病毒的中和能力证明（图 6A)。用 Envs A.Q 168、B.JRFL、B.SF162 和 C.ZM106 也显示出 了类似的结果（表 14 和 15)。 相反，克隆性世系成员抗自体同源T/F Env假病毒的中和活性较早出现，除mAb 1AH92U外， 在UCA之后，所有世系的成员有可测量的CH505T/F病毒的中和（图6A)。因此，在CH103 世系内，早期中间抗体中和了 T/F病毒，但后期中间抗体获得了中和宽度，这表明了具有亲 和力成熟的中和宽度的进化，并且CH103-CH106BnAb从早期自体同源中和抗体反应进化而 来。此外，克隆性世系是异源的，其具有在图6A中表示的、进化出中和宽度的世系的臂，和 能够仅调节自体同源T/F病毒中和的另一抗体臂。尽管某些逃逸病毒明显是随着时间流逝 出现的（表4)，但是需要重点指出的是，尽管逃逸突变体病毒驱动BnAb进化，但是BnAb仍 能够中和CH505T/F病毒（图6A)。应注意，重链世系中最早的突变在与gpl20的接触点近处 聚集，它们在整个研宄期间保持固定，但是后来累积的突变倾向于进一步来自于结合位点， 并可能更间接地影响结合（图10)。因此，CH103BnAbs的刺激以与在T/F Env上存在的核 心⑶4bs表位保持有活性的方式发生。可以解释这一点的一种可能性是，UCA结合的印迹 收缩至CH103成熟抗体的中央核心结合位点。获得具有T/F Env的UCA的晶体结构应知道 这一理念。另一种可能性是因为亲和力成熟在高度多样形式的⑶4bs表位的存在下发生， 选择在表位中和周边的倾向于耐受变异的抗体，而不是用特定逃逸Env来增加的亲和力的 那些抗体。在这两种情况下，将预料对T/F形式和早期病毒变异体的活性的持续性。图6B 和图16显示在抗体决定簇和被mAb CH103结合的Env表位的平行进化期间突变或者熵的 积累的视图。
[0097]
[0098]
[0099] 表3a. CH103和其他⑶4bs mAb抗25个进化枝A Env假病毒的中和活性的比较
[0100]
[0101] 值〈1 u g/ml以红色表示，值为1-50 y g/ml以绿色表示。
[0102] 对中和敏感性病毒计算几何平均值，IC5