化的珠的制备
[0171] 按以下的步骤将肽固定化在 xMAP Multi-Analyte COOH Microspheres (Luminex corporation、以下称为串珠）上。用MES缓冲液（0· IM MES-Na0H，pH7.0)清洗珠之后，通 过离心分离除去上清液。将其重复两次之后，将珠悬浮在75 μ L的MES缓冲液中。此时，加 入制备的lmg/mL的CTL表位肽溶液100 μ L，进一步加入10mg/mL EDCQ-乙基-3-(3-二 甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）5yL并充分混合之后，在30°C、暗处反应一夜。第二天，通 过离心分离而除去上清液后，加入IM Tris-HCl 125 μ L，在30°C、暗处孵育30分钟。除去 上清液后，用漂洗缓冲液（PBS (-)，0. 05% TWeen20)清洗两次，其后悬浮于免疫封闭剂（DS Pharma Biomedical)，由此完成CTL表位肽的固定化。
[0172] 实施例4CTL表位特异性IgG抗体滴度测定
[0173] 用大冢蒸馏水（大冢制药工场）以2mg/mL制备本发明的具有5个连接的表位的 肽，填充于B Braun Injekt注射器。在其它注射器中填充等量的IFA之后，将两注射器用 GP注射器连接器连接，使该具有5个连接的表位的肽溶液和IFA充分混合，由此制备乳液。 将其在CBFl小鼠（C57BL/6XBalb/c Fl)尾根部周围每周1次各100 yL、总计施用3次。 末次施用1周后，从小鼠采血，得到血清样品。作为对照组，使用PEP2、PEP3、PEP4、PEP5、 PEP7的各肽混合物（各lmg/mL)制备乳液，按与具有连接的5个表位的肽相同的日程进行 施用（混合物施用组）。
[0174] 在96孔过滤板中分配以免疫封闭剂稀释的CTL表位肽固定化的珠，用漂洗缓冲液 清洗后，以100 μ L/孔添加通过免疫封闭剂稀释了 200倍的小鼠血清样品。将板在30°C培 养器中以600rpm搅拌，培养90分钟。用漂洗缓冲液清洗3次后，以100 μ L/孔添加通过免 疫封闭剂稀释了 500倍的生物素化的抗小鼠 IgG(H+L) (Vector Labolatories)，在30°C、 600rpm搅拌条件下培养60分钟。用漂洗缓冲液清洗3次后，以100 μ L/孔添加通过免疫封 闭剂稀释了 500倍的链霉亲和素-R-藻红蛋白缀合物（Invitrogen)，在30°C、600rpm搅拌 条件下培养30分钟。用漂洗缓冲液清洗3次后，以100 μ L/孔添加漂洗缓冲液并将珠悬浮 后，用Bio-Plex Suspension Array System(BIO-RAD)测定各珠特异性结合的PE色素的平 均荧光强度。
[0175] CTL表位特异性IgG抗体滴度测定结果如图2所示。需要说明的是，图2表示：通 过将等量的IFA和大冢蒸馏水（大冢制药工场）混合制备的乳液，按与CTL表位肽混合物 以及具有5个连接的表位的肽相同的日程施用于小鼠的阴性对照组（以下，简称为IFA组） 的血清中CTL表位特异性IgG抗体滴度测定结果的比较，诱导了几倍的该IgG抗体的产生。
[0176] 如图2所示，与IFA组相比，在混合物施用组中没有观察到CTL表位特异性IgG抗 体产生的诱导。另一方面，确定了，施用具有5个连接的表位的肽的情况下，以高频率观察 到强的CTL表位特异性IgG抗体的产生的诱导，进而，该IgG产生的量通过所施用的具有5 个连接的表位的肽而显著地诱导数十倍至数百倍以上。另一方面，在TPV17那样的连接顺 序的5连接体中，没有观察到多个CTL表位特异性IgG抗体产生的诱导。
[0177] 以上的结果显示：与将构成具有5个连接的表位的肽的CTL表位肽进行混合而施 用相比，通过施用该具有5个连接的表位的肽将抗肿瘤免疫较强地活化。
[0178] 接受了癌症肽疫苗治疗的癌症患者中的CTL表位肽特异性IgG产生的诱导与表位 肽特异性CTL的诱导都有助于延长寿命的效果。因此，本发明与由已知的CTL表位肽和其 混合物构成的癌症肽疫苗疗法相比，可以产生优异的延长寿命的效果。因此，本发明的具有 5个连接的表位的肽可以作为癌症或起因于癌症的疾病的治疗剂和/或预防剂、癌症肽疫 苗优选使用，其与由已知的CTL表位肽和其混合物构成的癌症肽疫苗疗法相比，可以提高 治疗成绩。
[0179] 将本说明书中所引用的全部刊行物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书 中。
【主权项】
1. 一种具有5个连接的表位的肽，其从由以下的CTL表位肽：序列号1所示的肽 (PEPl)、序列号2所示的肽（PEP2)、序列号3所示的肽（PEP3)、序列号4所示的肽（PEP4)、 序列号5所示的肽（PEP5)、序列号6所示的肽（PEP6)、及序列号7所示的肽（PEP7)构成的 组中可以重复选择的5个肽经由接头分别连接而成，并且 所述具有5个连接的表位的肽具有选自以下的（1)~（12)的一个或多个特征： (1) 含有PEP5和PEP2经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (2) 含有PEP2和PEP4经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (3) 含有PEP4和PEP6经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (4) 含有PEP6和PEP3经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (5) 含有PEP4和PEPl经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (6) 含有PEPl和PEP3经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (7) 含有PEP4和PEP2经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (8) 含有PEPl和PEP4经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (9) 含有PEP5和PEPl经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (10) 含有PEP6和PEP5经由接头从N末端侧依次相邻的序列； (11) 在C末端含有PEP2 ;以及 (12) 在C末端含有PEP3。2. 根据权利要求1所述的具有5个连接的表位的肽，其包含在N末端含有PEP5和 PEP2、PEP6和PEP5、或PEP4和PEP6经由接头从N末端侧依次相邻的序列和/或在C末端 含有 PEP7 和 PEP3、PEP4 和 PEP3、PEP6 和 PEP3、PEPl 和 PEP3、PEP5 和 PEP2、PEP4 和 PEP2、 或PEP5和PEP3经由接头从N末端侧依次相邻的序列。3. 根据权利要求2所述的具有5个连接的表位的肽，其含有选自以下的（a)~（p)中 的序列： (a) PEP5-PEP2-PEP4-PEP7-PEP3 ； (b) PEP5-PEP2-PEP7-PEP3-PEP4 ； (c) PEP4-PEP6-PEP5-PEP7-PEP3 ； (d) PEP5-PEP2-PEP4-PEP6-PEP3 ； (e) PEP5-PEP2-PEP4-PEPl-PEP3 ； (f) PEP4-PEP5-PEP2-PEP7-PEP3 ； (g)PEP7-PEP3-PEP4-PEP5-PEP2； (h) PEP5-PEP7-PEP3-PEP4-PEP2 ； (i) PEP6-PEPl-PEP4-PEP5-PEP2 ； (j) PEP6-PEP5-PEPl-PEP4-PEP2 ； (k) PEP4-PEP5-PEPl-PEP6-PEP3 ； (l) PEP7-PEP2-PEP4-PEP5-PEP3 ； (m) PEP4-PEP2-PEP7-PEP5-PEP3 ； (n) PEP7-PEP2-PEP5-PEP4-PEP3 ； (o) PEP5-PEP2-PEP7-PEP4-PEP3 ;或 (p) PEP5-PEP2-PEP4-PEP3-PEP7, 其中，式中表示接头。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的具有5个连接的表位的肽，其中，所述接头为氨 基酸接头。5. 根据权利要求4所述的具有5个连接的表位的肽，其中，所述氨基酸接头为连接2个 精氨酸的精氨酸二聚体。6. -种CTL，其通过使用根据权利要求1~5中任一项所述的具有5个连接的表位的 肽刺激外周血淋巴细胞而得到。7. -种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其含有根据权利要求1~5中任一项所述 的具有5个连接的表位的肽、或根据权利要求6所述的CTL作为有效成分。8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其为免疫治疗剂。9. 一种癌症的治疗方法，其包括：将根据权利要求1~5中任一项所述的具有5个连 接的表位的肽、或根据权利要求6所述的CTL施用于癌症患者。10. -种针对癌症免疫受试者的方法，其包括：将根据权利要求1~5中任一项所述的 具有5个连接的表位的肽、或根据权利要求6所述的CTL施用于受试者。
【专利摘要】提供了一种癌症抗原肽，所述癌症抗原肽可作为癌症肽疫苗施用于广泛的癌症患者而不需要HLA分型检查、且不限于具有特定HLA分型的患者。通过将选自报道具有CTL诱导能力且来自肿瘤抗原分子的CTL表位肽的组中的5个CTL表位肽经由接头连接而得到具有5个连接的CTL表位的肽。
【IPC分类】C07K16/30, C07K19/00, A61K38/00, A61P35/00, A61P43/00, A61P37/04
【公开号】CN105008399
【申请号】CN201480013105
【发明人】深谷智史, 长田年弘, 和田浩志, 宇津木照洋
【申请人】大鹏药品工业株式会社
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2014年3月5日
【公告号】CA2901984A1, WO2014136814A1