:RS融合基因的克隆
[0058] 本试验使用的菌株和质粒，详见表1。
[0059] 表1本试验的菌株和质粒
[0060]
[0062] 1. 2相关溶液及缓冲液
[0063] 本试验使用的相关溶液及缓冲液，详见表2。
[0064] 表2本试验使用的溶液和缓冲液
[0065]
[0066] (一）4CL基因的制备
[0067] 扩增4CL基因的引物及其序列，详见表3。
[0068] 菌液PCR使用的通用引物及其序列，详见表4。
[0069] 表3扩增4CL基因的引物
[0070]
[0074] 所有引物均由北京博迈德基因技术有限公司合成。
[0075] 1、首先利用Trizol法提取拟南芥叶片总RNA
[0076] 试验具体步骤如下：
[0077] (1)将1. 5mL无RNase酶的离心管放置在离心管架上，取4°C保存的Trizol试剂 lmL，立即将离心管盖紧并放于冰上，备用；
[0078] (2)研钵用少量液氮进行预冷，取0.2g左右的拟南芥嫩叶片，迅速剪碎并放于提 前预冷的研钵内，在液氮中迅速研磨成粉末；
[0079] (3)将粉末迅速转入Trizol溶液中，轻轻混勾，室温放置8min ;
[0080] (4)向离心管中缓慢加入200 yL的氯仿后，立即涡旋震荡15s，室温静置2min ;
[0081] (5)将静置后的离心管放入提前预冷至4°C的离心机中离心5min(12000rpm);
[0082] (6)待样品分层稳定后，将500 y L的上清液移入新的无RNase酶离心管；
[0083] (7)向离心管中加入500 yL异丙醇，上下混匀后立即置于-80°C冰箱中，沉淀2h;
[0084] (8)室温条件下，冷冻样品缓慢解冻lOmin后高速离心10min(12000rpm);
[0085] (9)弃去上清液后加入lmL 80%乙醇，轻轻将沉淀振起；
[0086](10)放入4°C离心机离心5min (7500rpm)，将上清液小心地去除；
[0087] (11)用真空栗吸去余下的乙醇，在超净工作台中吹至乙醇完全挥发；
[0088] (12)向离心管中加入约30 y L的无RNase酶H20充分溶解沉淀，可在55°C水浴中 使未溶解的沉淀彻底溶解，长期保存应置于_80°C ;
[0089] (13)电泳检测提取总RNA的纯度与亮度（RNA电泳时，应将仪器装置洗干净，电泳 缓冲液也要重新配置，以减少RNA的降解）。
[0090] 2、拟南芥cDNA的合成
[0091] 本试验采用Beijing TransGen Biotech公司的反转录试剂盒，参照该试剂盒的说 明书，操作步骤如下：
[0092] (1)配制cDNA合成体系，详见表5;
[0093] 表5拟南芥cDNA合成体系
[0094]
[0095] 3拟南芥4CL基因片段的分离
[0096] 3. 1 PCR扩增4CL基因片段
[0097] 根据NCBI数据库中已有的拟南芥4CL (AY376729)基因的cDNA序列设计PCR特异 性扩增引物4CL-F1& 4CL-R
[0098]以拟南芥的cDNA为模板，ACL-FJPACL-Ri为引物，用2XGold Fast Pfu PCR MasterMix扩增拟南芥4CL基因片段。扩增体系见表6, PCR扩增程序如图1。
[0099] 表6拟南芥4CL基因PCR扩增体系
[0100]
[0101] PCR扩增终止后，取少量的PCR产物经1%的凝胶进行检测，并对结果进行分析。
[0102] 3. 2 4CL基因片段的回收
[0103] 采用北京博迈德生物技术有限公司的核酸凝胶纯化回收试剂盒对上述扩增的4CL 基因进行纯化回收，具体步骤如下：
[0104] (1)在长波长紫外灯下，用灼烧后的干净刀片迅速将含有目的基因片段的凝胶切 割分离下来，最终得到的凝胶体积应尽可能的小；
[0105] (2)迅速将切割下来的凝胶放入提前称重的1. 5mL离心管中，称取凝胶的净重；
[0106] (3)根据切割得到的凝胶重量，粗略地计算出体积，然后迅速加入3倍体积的溶胶 液DD (凝胶质量lmg，其体积约为1 y L);
[0107] (4)将加入溶胶液的离心管放在56°C的水浴中，每隔2min剧烈摇动一次，直到凝 月父完全溶解；
[0108] (5)将吸附柱EC放入收集管中，把溶胶液全部移入吸附柱EC中，室温静置lmin， 离心 30s(12000rpm);
[0109] (6)将500 yL漂洗液WB迅速加入到吸附住EC中，高速离心30s(12000rpm)后，弃 去滤液并重复此操作；
[0110] (7)为了尽可能的除去漂洗液WB，将吸附柱EC高速离心2min(13000rpm);
[0111] (8)将离心后的吸附柱EC安置在新的灭菌收集管中，50yL的ddH20从柱中 央缓慢加入（预热至55°C，洗脱效果更好），将回收片段室温溶解2min后高速离心 lmin (12000rpm)，所得产物在-20°C保存。
[0112] 4 4CL基因的克隆
[0113] 4. 1克隆载体pMD18-T及转化菌株E. coil JM109
[0114] 载体pMDIS-T是由pUC18载体经过特殊处理以后得到的常用克隆载体，具体处理 是在PUC18载体上插入了 EcoR V酶切位点以后经过该酶的单酶切反应，最后分别在3'端 添加碱基"T"。一般PCR扩增反应中使用的耐热性DNA聚合酶都会在所得到的扩增产物末 端继续延伸添加一个"A"碱基，形成3'粘性末端，正是由于这个特性，使得扩增产物能够 很高效、方便地连接到PMD18-T克隆载体上。本实验选用Takara公司的pMD18-T载体试剂 盒，所得连接产物可以直接转化宿主菌株，通过蓝白斑鉴定可以初步筛选出阳性克隆。
[0115] 本实验选择的宿主菌株是北京博迈德生物技术有限公司的E. coli JM109,利用连 接液转化该宿主菌细胞后，首先利用蓝白斑的方法初步筛选阳性重组子，然后再通过菌液 PCR与酶切鉴定。
[0116] 4. 2连接反应及转化
[0117] 参照克隆载体pMD18-T和E. coli JM109感受态的使用说明书，操作如下：
[0118] (1)将4CL基因回收片段和pMD18-T载体按照一定的比例配制连接反应体系，详见 表7;
[0119]表 7 pMD18-T/4CL 连接反应
[0120]
[0121] (2)在上述混合液中加入等量的Solution I连接液，16°C连接过夜；
[0122] (3)连接反应结束以后，将连接液全部转化到100 y L的E. coli JM109感受态中， 缓慢地将其摇匀后在冰浴中放置30min ;
[0123] (4)上述转化混合反应液在42°C水浴中加热90s后迅速在冰浴中冷却2min ;
[0124] (5)无菌条件下，将500 iiL的S0C培养基加到上述离心管中，然后恒温振荡培养 45min(37〇C,200rpm)；
[0125] (6)将上述培养的菌液在4000rpm的条件下离心30s，去除约350 y L的上清液，余 下摇匀后加到含有20mg/L的X-Gal、200mg/L的IPTG及50mg/L的Amp抗生素的LB平板上， 用涂布棒均匀涂开；
[0126] (7)将涂布后的平板密封后（用封口膜），37°C条件下静置15min(将菌液完全吸 收），最后将其倒置培养12h (37°C恒温条件下）。
[0127] 4. 3菌液PCR鉴定
[0128]挑取单菌落接种至lmL液体LB (Amp+，50mg/L)，37°C，200rpm培养12h。以通用引 物M13F(-47)与M13R(-48)为扩增引物。具体操作步骤如下：
[0129] (1)无菌条件下，将lmL的LB培养基（Amp+，50mg/L)加到无菌离心管中；
[0130] (2)用白枪头挑取平板上的白色菌落单斑，然后迅速将带有白色菌落的枪头放入 离心管中，恒温培养过夜（37°C，200rpm);
[0131] (4)按表8配制菌液PCR反应体系，并按照图2反应条件进行PCR反应。
[0132] 表8菌落PCR反应体系
[0133]
[0134] (5) PCR扩增终止后，取少量的PCR产物经1 %的凝胶进行检测，并对结果进行分 析，初步筛选出阳性重组菌。
[0135] 4. 4重组质粒的提取
[0136] 将上步初选得到的阳性重组菌按照1 : 50的比例接种至新鲜且预热的LB液体培 养基（Amp+，50mg/L)中，恒温培养过夜12h(37°C，200rpm)。本试验选用北京博迈德生物技 术有限公司的质粒提取试剂盒提取重组质粒，具体操作步骤如下：
[0137](1)取2mL菌液（分两次离心收集），离心30s (9000rpm)后尽量将上清除尽；
[0138](2)向上述离心管中缓慢地加入250 y L的溶液P1 (已加入指定量的RNase A)，剧 烈摇动至没有明显菌块；
[0139] (3)将250 yL的溶液P2缓慢的加入到上述溶解液中，上下摇动离心管7次，直至 菌体彻底破碎裂解成透明溶液；
[0140] (4)取350 y L的溶液P3加入到上述离心管中，迅速上下颠倒混匀7次（出现白色 絮状沉淀）后高速离心5min(12000rpm);
[0141] (5)缓慢地将离心所得的上部澄清溶液吸入至试剂盒中的吸附柱AC，然后离心 lmin(12000rpm)后弃尽滤液；
[0142] (6)将500 y L的溶液WB(已加入指定体积的无水乙醇！）吸取至吸附柱AC中，然 后高速离心30s(12000rpm)后弃去滤液；
[0143](7)吸附柱AC重新高速离心2min (13000rpm)，最大程度除去残留的溶液WB ;
[0144] (8)将吸附柱AC重新安置于灭菌离心管中，吸取50 y L的ddH20从柱中央缓慢地 加入（预热至55°C，洗脱效果更好），室温溶解2min后高速离心lmin (12000rpm)，所得产物 放于-20°C保存。
[0145] (二）花生RS基因的克隆
[0146] 扩增RS基因引物及其序列，详见表9。
[0147] 表9扩增RS基因的引物
[0148]
[0149] 菌液PCR所使用的通用引物及其序列，同表4。
[0150] 1、花生嫩叶总RNA的提取
[0151] 选用 Takara 公司的 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 试剂盒。试验 步骤具体如下：
[0152] (1)研钵用少量液氮进行预冷，取0. 2g左右的花生嫩叶片，迅速剪碎并放于提前 预冷的研钵内，在液氮中迅速研磨成粉末；
[0153] (2)在