行纯化 回收。
[0244] 2. 4. 2连接并转化
[0245] 将上述纯化的PMD19-T/4CL : :RS酶切片段与pET_30a酶切片段按3 : 1的比例 在八连接酶作用下连接。反应体系见表23。
[0246] 表 23 pET_30a/4CL : :RS 连接反应
[0247]
[0248] 16 °C连接过夜，转化方法及步骤参照拟南芥。
[0249] 2.5pET-30a/4CL: :RS 的阳性鉴定
[0250] 2. 5. 1 菌液 PCR 鉴定
[0251] 方法及步骤参照拟南芥。
[0252] 2. 5. 2酶切鉴定
[0253] 经菌液PCR鉴定为阳性的菌株按1 : 50重新过夜培养后，按前述步骤提取重组质 粒pET-30a/4CL : :RS，然后分别经过Nco I单酶切、EcoR I单酶切和Nco I与EcoR I的双 酶切鉴定。
[0254] Nco I单酶切反应体系见表24, EcoR I单酶切反应体系见表25, Nco I与EcoR I 双酶切反应体系见表26。
[0255] 37°C水浴反应3h，酶切产物纯化回收后用1%琼脂糖凝胶检测。
[0256] 4. 2. 5. 3测序分析
[0257] 将上述初步鉴定为阳性的菌液质粒送至公司进行测序。
[0258]表24 pET_30a/4CL : :RS的Nco I酶切反应
[0259]
[0264] 2. 6融合基因的诱导表达及其纯化
[0265] 2. 6. 1诱导表达
[0266] 将上述鉴定为阳性的重组菌以1 : 50的比例接种于5mL新鲜的LB培养基（Kan+， 30mg/L)中，过夜培养。然后又将培养物扩培至新鲜且预热的培养基中，恒温培养4h(37°C， 200rpm)后添加外源诱导剂IPTG至终浓度为0. 3mM，28°C诱导温度条件下诱导表达8h。
[0267] 2. 6. 2融合蛋白的纯化
[0268] 使用pET_30a表达载体，会使得表达的融合蛋白含有His标签，这种标签为检测与 纯化蛋白提供了方便。ProteinlsoTM Ni-NTA Resin是螯合金属Ni2+而形成的一种亲和 层析介质。该产品中的金属Ni2+对融合蛋白中的His标签具有特异吸附能力，从而使含有 His标签的蛋白通过与金属Ni2+结合之后被分离纯化。本实验具体步骤如下：
[0269] (1)样品的准备：约取50mL诱导菌液，4000rpm离心5min，尽可能地弃去上液；加 5mL的PBS溶液涡旋后立即置于冰上；菌液在冰水浴上超声破碎至透明；缓慢地将超声至透 明的液体移至新的灭菌离心管中，然后高速离心30min(13000rpm，4°C )，尽可能的将上清 液移至新的离心管中；室温条件下，小心地向离心管中加入适量的饱和硫酸铵溶液（盐析 表达蛋白）；待上清蛋白完全沉淀下来之后，小心地将溶液过滤去除，加入50mL的平衡缓冲 液，使上清蛋白沉淀重新溶解；上样前需经〇. 45 ym的过滤膜过滤。
[0270] (2)装柱与平衡：将25mL柱介质溶液充分混合均匀后，缓慢地加入到柱中。用 100mL的平衡缓冲液平衡柱子。
[0271] (3)上样与洗涤：将过滤后的样品缓慢地加入到柱子中，冰浴上轻摇lh后用100mL 的平衡缓冲液洗涤层析柱。
[0272] (4)洗脱：洗涤结束后，用50mL的洗脱缓冲液洗脱层析柱，收集流出液。
[0273] (5)检测：在200 yL的离心管中分别取lOiiL纯化前后的蛋白样品液，然后分别 加入10 y L的2XSDS上样缓冲液，全部煮沸3min后经蛋白胶检测。
[0274] 2. 7Western blot分析
[0275] 提取总蛋白后配制蛋白胶，根据融合基因编码的氨基酸序列，预测融合蛋白的大 小应该在104kDa左右，故分离胶的浓度应采用8%，浓缩胶仍然采用5%。10mL8%的分离 胶配方如表4-15,4mL5%的浓缩胶配方如表27。待分离胶凝聚后，慢慢倒出重蒸水并用滤 纸充分吸干，然后将充分摇匀的浓缩胶加入到玻璃板中，迅速将样品梳插入。
[0276] 表27 8%分离胶的配方
[0277]
[0278] 2.7. 3SDS-PAGE电泳：
[0279] (1)点样：将已处理好的蛋白样品分别以5yL样品，lOiiL样品，15yL样品， 20 y L样品顺序加入加样孔中，此时选择的预染蛋白分子量Marker的加样量为7 y L ;
[0280] (2)电泳：浓缩胶80V，分离胶120V电泳，至前沿l_2cm时停止。
[0281] 2. 7. 4转膜
[0282] (1)电泳结束后，小心的将玻璃板撬开，去除浓缩胶后在分离胶的右上角切去一小 块作为标记，用转移缓冲液湿润凝胶；
[0283] (2)根据得到分离胶的大小，小心地剪取滤纸和PVDF膜，剪取过程中应保证与最 终分离胶的大小相一致。将剪取的滤纸和PVDF膜首先在甲醇溶液中浸泡5min，然后转移至 电转缓冲液中浸润平衡30min，备用；
[0284] (3)将转移夹板的黑色底板（负极）朝下，依次放海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF 膜、三层滤纸、海绵垫，注意每层之间都要将气泡赶尽；
[0285] (4)向电转槽内加入适量的电转缓冲液，盖紧槽盖，连通电源。同时要将整个电转 装置放入冰浴（或4°C冰箱），80V恒压电转lh ;
[0286] (5)电转后，观察预染蛋白分子量Marker的转移情况分析目标蛋白是否转移完 全。
[0287] 2. 7. 5ffestern blot
[0288] (1)封膜：将电转完毕的PVDF膜标记后，转移至封闭液中室温振摇封闭2h ;
[0289] (2) -抗孵育：用滤纸将经过封膜之后PVDF膜的残留液除尽。将膜正面朝上放入 杂交袋中，用一抗[His抗体sc-803]进行杂交。4°C孵育过夜，在平皿中用TBST溶液漂洗 3次，每次lOmin ;
[0290] (3)二抗孵育：将膜正面朝上放入另一杂交袋中，加入二抗[ProteinFind Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，HRP Conjugate]稀释液（1 : 1000)，室温条件下振荡孵育 lh 后，在 平皿中用TBST溶液漂洗3次，每次lOmin。取出膜，在滤纸上沥干TBST缓冲液；
[0291](4)ECL发光：将膜浸入发光液（临用前配制），室温孵育3min，曝光照相。
[0292] 3、结果与分析
[0293] 3. 1 4CL : :RS融合基因的克隆
[0294] 分别将PCR扩增得到的基因片段I和基因片段II进行琼脂糖凝胶电泳检测。琼 脂糖凝胶电泳结果显示基因片段I序列大小约为1700bp，这与理论上将4CL基因去除终 止密码子TGA，上游引入Nco I酶切序列和下游引入15bp (含BamH I酶切序列）的一段 Linker核苷酸序列之后得到的基因片段大小相符。电泳图还显示基因片段II序列大小约 为1200bp，这与理论上将RS基因去除起始密码子ATG，上游引入30bp (含BamH I酶切序 列）的另一段Linker核苷酸序列和下游引入EcoR I酶切序列之后得到的基因片段大小相 符。分别将这两个基因片段割胶回收，经过BamH I单酶切后进行过夜连接，最后以连接产 物为模板，4CL : AS-FidCL : :RS-R2S引物进行扩增，得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测 (图6)，电泳图显示得到的片段大小为2913bp，这与理论设计的4CL : :RS融合基因序列大 小相一致，割胶回收4CL: :RS融合基因片段。
[0295] 3. 2 4CL : :RS融合基因的序列分析
[0296] 测序结果表明，4CL : :RS融合基因全长为2895bp，包括去除终止密码子的4CL基 因片段（1693bp)、去除起始密码子的RS基因片段（1167bp)以及柔性linker的45个核苷 酸，与原设计一致。DNAMAN软件分析构建的4CL : :RS融合基因的核苷酸序列及其编码的氨 基酸序，加框的ATG为4CL : :RS融合基因的起始密码子，中间45个加框序列为linker的 核苷酸序列，下划线序列CCATGG，GGATCC，GAATTC分别代表着Nco I、BamH I和EcoR I酶切 位点。进一步分析表明4CL : :RS融合基因共编码964个氨基酸，分子量（Mr)为104. 7kDa， pi 为 5. 63。
[0297] 3. 3原核表达载体的鉴定
[0298] 3. 3. 1 菌液 PCR 鉴定
[0299] 菌液PCR鉴定结果经琼脂糖凝胶电泳检测（图7)，阴性对照扩增片段大小为 410bp，表明空载体上T7上下游引物之间序列为410bp，菌液与连接产物扩增片段大小都为 338 lbp，与融合基因序列及酶切序列对比表明原核表达载体已构建成功。
[0300] 3. 3. 2酶切鉴定
[0301] 提取经菌液PCR鉴定为阳性的菌株质粒，分别经Nco I与EcoR I单酶切及其双酶 切反应，酶切结果经琼脂糖凝胶电泳检测（图8):重组质粒单酶切片段大小为8303bp，双酶 切片段大小分别为：5408bp和2895bp，前者与双酶切pET-30a空载体得到的片段相符，后者 与融合基因4CL : :RS片段大小相符，进一步验证了构建成功的原核表达载体。
[0302] 3. 3. 3测序鉴定
[0303] 将上述初步鉴定为阳性的菌液送至测序公司进行测序。测序结果表明，融合基因 4CL : :RS已成功地通过Nco I与EcoR I酶切位点连接到pET-30a原核表达载体。
[0304] 3.4 4CL: :RS融合基因的诱导表达
[0305] 通过外源添加蛋白表达诱导剂（IPTG)对目的融合蛋白进行诱导表达，SDS-PAGE 电泳检测（图9)，电泳图结果表明重组菌诱导表达的融合蛋白分子量约为105kDa，这与利 用相关软件分析预测的融合蛋白分子量大小相一致。收集表达后的菌体，低温超声破碎后， 4°C，13000rpm离心30min，将上清液通过Proteinlso Ni-NTA Resin纯化，收集纯化后的蛋 白并通过SDS-PAGE胶检测分析（图10)。
[0306] 3. 5Western blot 分析
[0307] 将构建的重组菌在28°C诱导条件下诱导表达8h，收集表达的蛋白经过Western blot分析，结果如图10所示。结果表明胶图中有一条亮带，分子量约为105kDa，这进一步 说明了构建的原核表达载体pET-30a/4CL : :RS成功地表达出了目的融合蛋白，这为后面的 重组菌发酵制备白藜芦醇提供了基础。
[0308] 实施例2利用重组菌株发酵制备白藜芦醇的方法
[0309]使用的菌株是实施例1所构建的重组菌株BL21 (DE3)，并携带重组质粒 pET-30a/4CL：：RS〇
[0310] 1、白藜芦醇标准曲线的建立
[0311] 精确称取白藜芦醇标准品0.0010g溶解于色谱甲醇中，并用色谱甲醇定容至lmL， 即为1000mg/L的标准品溶液，并按照比例与色谱