1. 5mL无RNase酶离心管中加入450 y L的溶液Buffer PE，小心加入约50mg 的粉末状样品，上下剧烈震荡直至离心管中无明显花生嫩叶的粉末；
[0154] (3)将摇匀后的离心管放入提前预冷至4°C离心机中高速离心5min(12000rpm);
[0155] (4)缓慢地将离心管上部澄清溶液移至新的无RNase酶离心管中，然后迅速加入 40 y L的Buffer NB，剧烈振荡使其混匀；
[0156](5)上述混合液在4°C条件下高速离心5min(12000rpm)，然后将离心管上部的澄 清溶液移至新的无RNase酶离心管；
[0157] (6)向离心管中加入450 y L的Buffer RL(已加入指定体积的50XDTT Solution)，轻轻地将溶液混勾；
[0158] (7)将450 yL的无水乙醇迅速加入至上述离心管中（会出现少量白色絮状沉 淀），上下颠倒离心管使其混匀；
[0159] (8)迅速地将含有沉淀的混合液吸入到RNA Spin Column(安置在Collection Tube内）中，然后高速离心lmin(12000rpm)后小心弃去滤液；
[0160] (9)吸取500 y L的溶液Buffer RWA至上述RNA Spin Column中，然后高速离心 30s(12000rpm)后小心弃去滤液；
[0161] (10)吸取600 y L的溶液Buffer RWB至上述RNA Spin Column中，然后高速离心 30s(12000rpm)后小心弃去滤液；
[0162] (11)重复操作步骤（10);
[0163] (12)为了彻底清除残余溶剂，将上述离心后的RNA Spin Column重新安置在收集 管中高速离心2min(12000rpm);
[0164] (13)将RNA Spin Column重新放置在新的离心管中，100 y L无RNase酶H20缓慢 加入（预热至55°C，洗脱效果更好），室温溶解5min后高速离心2min (12000rpm)，所得产物 放于-20°C保存，若长期保存需放于-70°C ;
[0165] (14)电泳检测提取总RNA的纯度与亮度（RNA电泳时，应将仪器装置洗干净，电泳 缓冲液也要重新配置，以减少RNA的降解）。
[0166] 2花生cDNA的合成
[0167] (1)方法及操作同拟南芥cDNA的合成。但此时的反应体系见表10。
[0168] 表10拟南芥cDNA合成体系
[0169]
[0170] (2)反应液轻轻混勾后，50°C条件下反转录30min，85°C加热5min以停止反应，反 应产物在4°C条件下保存。
[0171] 3花生RS基因片段的分离
[0172] 3. 1PCR扩增RS基因片段
[0173] 根据NCBI数据库中已有的花生RS基因（AY170347)的cDNA序列设计PCR特异性 扩增引物RS-F1及RS-R1 :
[0174] 以花生cDNA为模板，RS-F1 和RS-R1 为引物，用 2XGold Fast Pfu PCR MasterMix 扩增花生RS基因片段。扩增体系见表11，PCR扩增程序如图2。
[0175] 表11 RS基因PCR扩增体系
[0176] Tab. 3~3 The PCR amplification system for the RS gene
[0177]
[0178] PCR扩增终止后，取少量的PCR产物经1%的凝胶进行检测，并对结果进行分析。
[0179] 3.2RS基因片段的回收
[0180] 方法及操作步骤同拟南芥4CL基因片段的回收。
[0181] 4、RS基因的克隆
[0182] 4. 1连接反应及转化
[0183] 方法及操作步骤同拟南芥。但此时的连接反应体系见表12。
[0184] 表 12 pMD18-T/RS 连接反应
[0185]
[0186] 4.2菌液？0?鉴定
[0187] 方法及操作步骤参照拟南芥。
[0188] 4. 3重组质粒的提取
[0189] 方法及操作步骤参照拟南芥。
[0190] (三）4CL: :RS融合基因的克隆、表达
[0191] 1、引物
[0192] 4CL: :RS融合基因的扩增引物及其序列，详见表13。
[0193] 菌液PCR需要的通用引物及其序列，详见表14。
[0194] 表13扩增4CL : : RS融合基因的引物
[0195]
[0197] 注：小写字母为柔性linker的编码序列。
[0198] 表14基因片段I的PCR扩增体系
[0199]
[0200] 2、实验方法
[0201] 2. 1柔性linker的设计
[0202] 本研究中所设计的柔性linker是指在4CL和RS酶蛋白之间接入一段起连接作用 的过渡氨基酸链，它具有一定的柔性能够使得4CL和RS酶蛋白各自保留活性，同时又能提 高总酶促反应效率。本实验设计的linker序列为GGGGS GGGGS GGGGS，并将柔性linker的 核苷酸序列设计为 ggt gga ggcRRa tcc(BamH I) ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg〇
[0203] 2. 2引物设计
[0204] 设计引物主要是为了能够将linker编码的核苷酸序列引入到4CL基因和RS基因 之间。然而根据引物设计原则，若将linker核酸序列中BamH I酶切位点后的序列都设计到 第二个基因（RS)的上游引物中，会使得此条引物的长度高达63bp，这样会大大降低引物特 异性，因此将此条引物分成两条设计。4CL: :RS-FJP4CL: AS-Ri为第一个基因（4CL)的 上、下游引物，4CL: :RS-F#引入了 Nco I酶切位点（CCATGG)，4CL: AS-Ri在引入BamH I酶切位点的同时又将4CL基因的终止密码子TAG敲除；4CL : :RS-F21、4CL : :RS-F22、4CL :: RS-R2为第二个基因（RS)的上、下游引物引物，4CL::RS-F 22在引入BamH I酶切位点的同时 又将RS基因的起始密码子ATG敲除，在下游引物4CL : :RS-R2*引入酶切位点EcoR I (GAA TTC)。
[0205] 2. 3 4CL : :RS融合基因的构建
[0206] 2. 3. 1基因片段I的合成
[0207] 以 pMD18-T/4CL 为模板，4CL : AS-FMCL : AS-Ri为引物合成基因片段 I : (Nco I)CCA TGG+4CK-TGA) +ggt gga ggc gga tcc (BamH I)。反应体系如表 4, PCR 反应程序如 图3。
[0208] 2. 3. 2基因片段II的合成
[0209] 以 pMD18-T/RS 为模板，先以 4CL: :RS-F21，4CL: :RS-R#引物进行扩增，将 PCR 产物割胶回收后，再以割胶回收产物为模板，4CL: :RS-F22,4CL: :RS-R2S引物合成基因 片段 II : (BamH I) Rga tcc ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tca+RS (~ATG) +GAA TTC(EcoR I)。反应体系如表15,表16, PCR反应程序如图4。
[0210] 表15基因片段II的PCR扩增1
[0211]
[0214] 2. 3. 3单酶切反应
[0215] 将上述基因片段I和基因片段II分别割胶回收后进行BamH I单酶切反应，单酶 切反应体系详见表17,表18。
[0216] 表17基因片段I的BamH I单酶切反应
[0217]
[0220] 37 °C孵育3h，将上述反应产物分别经Takara公司的TaKaRaMiniBEST DNA fragment purification kit试剂盒纯化回收。参照试剂盒说明书，操作步骤如下：
[0221] (1)根据酶切反应体系确定向上述各酶切反应液中加入的Buffer DC的体积（体 积应为酶切反应体积的三倍）；
[0222] (2)将上述混合液缓慢地吸入到Spin Column中（安置在Collection Tube内）， 然后高速离心lmin(12000rpm)后弃去滤液；
[0223] (3)取7〇0 y L溶液Buffer WB加到 Spin Column 中（重新安置在Collection Tube 内），然后高速离心30s (12000rpm)后弃去滤液；
[0224] (4)重复操作步骤⑶；
[0225] (5)为了彻底去除溶剂Buffer WB，以减少对下游实验的影响，现将Spin Column 重新高速离心2min(13000rpm);
[0226] (6)将Spin Column重新安置于灭菌离心管中，吸取25 y L的ddH20从柱中央缓慢 加入（预热至55°C，洗脱效果更好），室温溶解2min后高速离心lmin (12000rpm)，所得产物 放于-20°C保存。
[0227] 2. 3. 3连接与转化
[0228] 将单酶切反应回收得到的两个基因片段在T4DNA Ligase条件下按1 : 1进行连 接。连接反应体系详见表19。
[0229] 表19 4CL : :RS基因的连接反应
[0230]
[0231] 16°C连接过夜。考虑到连接效率不高以及连接产物不纯，本实验又以连接产物为 模板，4CL : AS-FidCL : :RS-R2为引物进行PCR扩增，反应体系如表10，PCR反应程序如图 5〇
[0232] 表 20 4CL : :RS 基因 PCR 扩增
[0233] Tab. 10 The PCR amplification system for the 4CL：：RS gene
[0234]
[0235] PCR扩增终止后，将PCR产物经1 %的凝胶进行检测，并对结果进行分析。按照 2. 2. 3. 2步骤回收基因片段4CL: :RS，回收片段连接到pMD19-T载体并转化JM109感受 态。无菌条件下，挑取单克隆阳性菌落至新鲜培养基恒温培养12h(37°C，200rpm)后送至公 司进行测序。
[0236]2.4pET_30a/4CL ::RS 的构建及其转化
[0237] 2. 4. 1双酶切反应
[0238] 选取上述测序正确的菌株，按照前述方法提取重组质粒pMD19-T/4CL : :RS。重组 质粒PMD19-T/4CL : :RS与原核表达载体pET-30a分别经Nco I和EcoR I双酶切。反应体 系见表21，22。
[0239] 表 21 pMD19-T/4CL : :RS 双酶切反应
[0240]
[0243] 在37°C条件下酶切反应3h。参照2. 2. 6. 2的方法对上述各个产物分别进