_二 氢-5H-2-呋喃酮（IA)的其它制备方法。
[0171] 在第一实施方式A13E1中，本发明提供了 5-羟基-4-(2-甲基丙基）-3,4_二 氢-5H-2-呋喃酮（IA)的其它制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0172] (a)获得3-亚异丁基-2-氧代戊二酸（XIIA)或其环化的异构体（XII B)
[0173]
[0174] (b)相继或同时地还原碳-碳双键和使a _酮酸官能团脱羧基。
[0175] 在其它的实施方式A13E2中，本发明提供了根据实施方式A13E1的方法，其中在 a _酮酸官能团的脱羧基之前还原碳-碳双键以提供3-亚异丁基-2-氧代戊二酸（XV)或 其环化的异构体（XVA)
[0176]
[0177] 在其它的实施方式A13E3中，本发明提供了根据实施方式A13E1的方法，其中在 碳-碳双键的还原之前使a -酮酸官能团脱羧基以提供3-甲酰基-5-甲基-3-戊烯酸 (XVI)或其环化的异构体（XVIA)
[0178]
[0179] 在其它的实施方式A13E4中，本发明提供了根据实施方式A13E1的方法，其中同时 地使a-酮酸官能团脱羧基和还原碳-碳双键。
[0180] 在其它的实施方式A13E5中，本发明提供了根据实施方式A13E1、A13E2、A13E3或 A13E4的方法，其中脱羧反应在脱羧酶的存在下进行。
[0181] 在其它的实施方式A13E6中，本发明提供了根据实施方式A13E1、A13E2、A13E3、 A13E4或A13E5的方法，其中碳-碳双键的还原在稀酮还原酶（enoate reductase)的存在 下进行。
[0182] 在另一个方面A14中，本发明提供了选自以下的化合物：
[0183] 3-亚异丁基-2-氧代戊二酸；
[0184] 3-异丁基-2-氧代戊二酸；和
[0185] 3-甲酰基-5-甲基-3-戊烯酸，
[0186] 或其盐、（Q-Q)烷基酯或环化异构体。
[0187] 在另一个方面A15中，本发明提供了（S)-3_氨甲基-5-甲基己酸（(S)-II)或其 药学上可接受的盐的制备方法
[0188]
[0189] ，所述方法包括以下步骤：
[0190] (a)使用根据如上定义的实施方式 A13E1、A13E2、A13E3、A13E4、A13E5SA13E6 2 任一的方法制备5-羟基-4-(2-甲基丙基）-3, 4-二氢-5H-2-呋喃酮（IA)，和
[0191] (b)将所述5-羟基-4- (2-甲基丙基）-3, 4-二氢-5H-2-呋喃酮转化为（S) -3-氨 甲基-5-甲基己酸。
[0192] 在另一个方面A16中，本发明提供了将（R)-3_氨甲基-5-甲基己酸转化为 (S)-3-氨甲基-5-甲基己酸的方法，其包括用转氨酶或胺氧化酶/亚胺还原酶处理 (R)-3-氨甲基-5-甲基己酸。
[0193] 在另一个方面A17中，本发明提供了用于增加（S)-3_氨甲基-5-甲基己酸在 (R)-和（S)-3-氨甲基-5-甲基己酸的混合物中的比例的方法，包括用转氨酶或胺氧化酶/ 亚胺还原酶处理所述混合物。
[0194] 在另一个方面A18中，本发明提供了可用于将5-羟基-4-(2_甲基丙基）_3,4_二 氢-5H-2-呋喃酮（I A)转化为普瑞巴林的转氨酶。
[0195] 在第一实施方式A18E1中，本发明提供了具有与下列氨基酸序列具有至少95%同 源性的氨基酸序列的转氨酶
[0196] mnkpqswearaetyslygftdmpslhx27rgtvvvthgegpyx41vdvx45grryldansglynmvagfdh KGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRK iltrx147nayhgvtavsasmtgx163px165nsvfglplpgfvhlx180cphywrygeegeteeqfvarlareleetiqre GADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTA gffpvgavilgpelx304krletaieaieefphgftax324ghpvgcaialkaidwmneglaenvrrlaprfeerlkhi aerpnigeyrgigfmwaleavkdkasktpfdgnlsvsx401riantcx408dlglicx415x416x417gqsvilx424ppfil TEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ ID NO. 1)
[0197] 其中
[0198] x27选自谷氨酰胺（Q)和谷氨酸（E);
[0199] x41选自异亮氨酸（I)和缬氨酸（V);
[0200] x45选自天冬酰胺（N)和组氨酸（H);
[0201] x147选自天冬酰胺（N)和谷氨酰胺（Q);
[0202] X163选自亮氨酸（L)和甲硫氨酸（M);
[0203] X165选自酪氨酸（Y)和组氨酸⑶；
[0204] xls°选自苏氨酸⑴；甘氨酸（G)和丝氨酸⑶；
[0205] x3°4选自丙氨酸（A)和丝氨酸⑶；
[0206] X324选自甘氨酸（G)和丝氨酸（S);
[0207] x4M选自赖氨酸（K)和谷氨酸（E);
[0208] x4°s选自苏氨酸⑴和谷氨酰胺（Q);
[0209] x415选自丝氨酸⑶和丙氨酸（A);
[0210] x416选自脯氨酸（P)和丙氨酸（A);
[0211] x417选自亮氨酸（L)和甲硫氨酸（M);和
[0212] X424选自半胱氨酸（C)和丝氨酸⑶。
[0213] 在其它的实施方式A18E2中，本发明提供了根据实施方式A18E1的具有SEQID NO. 1的氨基酸序列的转氨酶。
[0214] 在其它的实施方式A18E3中，本发明提供了根据实施方式A18E1或A18E2的转氨 酶，其中：
[0215] X27是谷氨酸（E);
[0216] X147是谷氨酰胺（Q);
[0217] X165是组氨酸（H);
[0218] X3。4是丝氨酸（S);
[0219] X324是甘氨酸（G);
[0220] X401 是赖氨酸（K);
[0221] X4°s是谷氨酰胺（Q);
[0222] X416是丙氨酸（A);
[0223] X417是甲硫氨酸（M);和
[0224] X424是丝氨酸（S)。
[0225] 在其它的实施方式A18E4中，本发明提供了根据实施方式A18E2的具有选自下列 的氨基酸序列的转氨酶：
[0232] 在另一个方面A19中，本发明提供了（S)-3_氨甲基-5-甲基己酸（(S)-II)或其 药学上可接受的盐的制备方法
[0233]
[0234] ，所述方法包括用根据实施方式A18E1、A18E2、A18E3和A18E4之任一的转氨酶处 理5-羟基-4-(2-甲基丙基）-3, 4-二氢-5H-2-呋喃酮（IA)和胺的步骤。
[0235] 优诜实施方式的详细描沐
[0236] 术语"烷基"是指含有指定数目的碳原子的直链或支链饱和脂肪烃基（radical)。 烷基的例子包括甲基，乙基，n-丙基，异丙基，n-丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，新戊基和 n-己基。
[0237] 术语"烷氧基"是指由连接至氧原子的如上定义的烷基构成的基团。烷氧基的离 子包括甲氧基，乙氧基和异丙氧基。
[0238] 术语"烷氧基-烷基""是指其中烷氧基取代了烷基氢原子的直链或支链饱和脂肪 烃基。烷氧基-烷基的例子是2-甲氧基乙基。
[0239] 术语"卤代烷基"是指其中一个或多个氢原子被氟、氯、溴或碘替换的如上定义的 烷基。当多于一个氢原子被替换时，替换的卤素原子可以是相同的或不同的。卤代烷基的 例子包括氟甲基，二氟甲基，三氟甲基，氯二氟甲基，2, 2, 2-三氟乙基和3-溴丙基。
[0240] 术语"芳基"是指苯基或萘基。
[0241] 术语"芳基-烷基"是指其中芳基取代了烷基氢原子的直链或支链饱和脂肪烃基。 芳基-烷基的例子是苄基。
[0242] 术语"环烷基"是指含有指定数目的碳原子的饱和单环或多环碳环。单环环烷基 的例子包括环丙基，环丁基，环戊基和环己基。多环环烷基的例子包括二环[2, 2, 1]庚基和 二环[3, 2, 1]辛基。
[0243] 关于烷基或芳基的术语"任选取代"是指烷基或芳基的氢原子可以被列出的基团 之一替换。取代可以在烷基或芳基中的任何位置发生。当任选取代是使用"一个或多个基 团"时，则烷基或芳基的任何数目的氢原子，多至等于存在于烷基或芳基中的氢的数目的最 大数目，可被替换，并且各替换是相互独立的。
[0244] 术语"对映体过量"，有时缩写为"e. e. "，是对于给定的样品，一种对映体超过其对 映异构体的过量的测量并表达为百分比。对映体过量定义为：
[0245] 100x (er~l) / (er+1)
[0246] 其中"er"是量较多的对映体对量较少的对映体的比率。
[0247] 5-羟基-4- (2-甲基丙基）-3, 4-二氢-5H-2-呋喃酮（IA)是3-氨甲基-5-甲基 己酸（II)的制备中的适宜的中间体。在化学还原剂的存在下用氨对外消旋（I A)的处理提 供了外消旋的3-氨甲基-5-甲基己酸（(R/S)-II)(见TO2008/127646A2)。推测该反应牵 涉开环的异构体（I B)。
[0248]
[0249] 在转氨酶的存在下使用胺供体的还原性胺化可提供对映体富集的3-氨甲 基-5-甲基己酸。合适的胺供体是伯胺例如单-烷基胺，特别是异丙胺，和a_氨基酸。
[0250]
[0251] (IA)与适合的胺脱氢酶/亚胺还原酶在氨的存在下的反应也可以是对普瑞巴林的 合适途径。可能需要化学计算量的辅助因子例如NADH或NADPH，或可包括第二氧化还原酶 例如甲酸脱氢酶以再循环辅助因子。
[0252]
[0253] 其中二氢呋喃酮（IA)在C-4位置上具有确定的立体化学，此立体化学可在还原性 胺化反应过程中被保留。由于普瑞巴林具有（S)-立体化学，可优选具有已经存在于二氢呋 喃酮中的此立体化学。
[0254]
[0255] 可选择地，二氢呋喃酮（IA)可以以外消旋形式使用。随后可以通过在允许单一对 映体的立体选择性形成的条件下进行还原性胺化反应，例如通过在转氨酶的存在下进行转 化，或通过使产物经历单独拆分步骤，例如通过与手性酸或碱结晶，来获得产物的所需的立 体异构体。
[0256] 可通过使用下文示出的方法以外消旋或对映体富集形式方便地制备二氢呋喃酮 (IA)。
[0257] 在第一方法中，二氢呋喃酮（IA)通过还原5-羟基-4_(2-甲基-1-丙烯 基）-5H-2-呋喃酮（VI A)制备。
[0258]
[0259] 该还原可通过在合适的催化剂的存在下进行氢化来方便地完成。合适的催化剂包 括均相和多相催化剂。催化剂一般包括过渡金属例如钯、铂、铑、钌或镍，或其盐或氧化物。 多相催化剂包括细碎的金属和衬底支持的金属和金属氧化物，其中衬底可以是碳、二氧化 硅，氧化铝或任何其它合适的惰性材料。均相催化剂包括过渡金属的膦配位体络合物。当 膦配体为手性时，则催化剂是手性的。当使用非手性催化剂时，则产物是外消旋二氢呋喃酮 (I A)。手性催化剂的使用可以以对映选择性方式提供二氢呋喃酮（IA)。
[0260] 当反应在碱性介质中进行时可改善氢化反应的选择性和总产率。不受理论束缚， 据信在碱的存在下呋喃酮主要以开环的盐（IX)存在。
[0261]
[0262] 可以使用任何合适的碱，只要它不干扰氢化过程，例如通过使催化剂中毒。合适的 碱的例子包括碱（例如Li，Na，K和Rb)和碱土金属（例如Ca和Mg)氧化物、氢氧化物、碳 酸盐和碳酸氢盐。还可使用其它金属盐，例如锌盐。由于其良好的溶解性和/或低毒性，碱 金属盐可以是优选的。胺碱例如氨以及伯、仲和叔胺可用于制备铵盐。还可使用四烷基氢 氧化铵，导致四烷基铵盐的形成。
[0263] 式（IX)的盐的氢化提供了式⑴的盐。
[0264]
[0265] 在氢化反应之后，通过用合适的酸处理该盐来回收二氢呋喃酮（IA)。可选择地，可 通过用转氨酶或胺氧化酶/亚胺还原酶处理来将该盐直接转化为3-氨甲基-5-甲基己酸 (II)。在这种情况下，可优选使用铵盐（M+=NH4+)或烷基伯铵盐（M+ =烷基-NH/)，因为铵 或烷基铵离子提供了酶的辅底物。异丙基铵盐与转氨酶的组合使用是优选的例子。
[026R1
[0267] 其中R不是氢的式（VI)的呋喃酮还可通过氢化还原。当R是烷基、卤代烷基、烷 氧基烷基烯基、环烷基、环烷基-烷基、芳基或芳基-烷基时，这些呋喃酮可以从式（VIA)的 化合物通过与醇R-0H在酸催化剂的存在下反应来制备。当R是(0)-时，呋喃酮可以从 式（VIA)的化合物通过与酸酐（#-(：(0) )20或酰基氯#-(：(0)-C1任选在碱例如叔胺的存在 下反应来制备。当R是R2-S02-时，呋喃酮可以从式（VIA)的化合物通过与磺酰氯R2-S02-C1 任选地在碱例如叔胺的存在下反应来制备。
[0268] 在氢化步骤后，式（IA)的二氢呋喃酮可以从还原产物通过用酸（当R是烷基、 卤代烷基、烷氧基烷基烯基、环烷基、环烷基-烷基、芳基或芳基-烷基时）或碱（当R是 Ri-C(0)-或R2-S02-时）处理来产生。
[0269] 手性R基团的使用可提供手性氢化产物而无需手性催化剂。
[0270] 例如，呋喃酮（VIA)与手性醇R*-〇H反应以提供手性醚衍生物（VIB)。
[0271]
[0272] 合适的手性醇可包括a-芳基醇例如1-苯基乙醇和1-萘基乙醇，以及萜烯醇例 如薄荷醇和冰片。衍生物（VIB)的氢化可以以对映选择性方式进行，随后用合适的酸处理 所得到的产物并在水的存在下提供手性形式的二氢呋喃酮（IA)。
[0273]
[0274] 呋喃酮（VIA)可从式（VII)的化合物通过在酸催化剂的存在下用水处理式（VII) 的化合物来制备
[0275]
[0276] 其中-K-表不单键、-CH2-、-〇_、-NH-、_N( (C「C3)烷基）_、-N(苄基）_、或
[0277]
[0278] 。合适的酸包括无机酸例如硫酸。可选择地，式（VII)的化合物可以用醇R-0H处 理以直接提供式（VI)的化合物，其中R是烷基、卤代烷基、烷氧基烷基烯基、环烷基、环烷 基-烷基、芳基或芳基-烷基。
[0279] 式的化合物（VII)可以通过式（VIII)的二烯胺与乙醛酸或其水合物的反应来制 备。
[0280]
[0281] 其中-Y_ 表不单键、-CH2-、-〇_、-NH-、_N( (CfCj 烷基）_、-N(苄基）_、或
[0282]
[0283] 应理解，式（VII)中的-X-相应于式（VIII)的起始材料中的-Y-，除了当-Y-是
[0284]
[0285] 其中-Y-表示单键或-CH2-的式（VIII)的化合物已通过4-甲基-2-戊烯醛与吡 咯烷或哌啶的反应来制备（Kienzle, F.等人，Helv. Chim. Actal985, 68 (5)，1133-39)。可以 类似地制备式（VIII)的其它化合物。
[0286] 可选择地，异丁醛和乙醛在合适的胺例如吡咯烷、哌啶或吗啉的存在下与溶剂例 如乙腈中的催化酸的缩合提供二烯胺衍生物（VIII)。
[0287]
[0288] Y =单键、CH2、0、N(烷基）、N(苄基）
[0289] 如果哌嗪用作胺，则获得双-二烯胺。
[0290]
[0291] 其中Y是NH的式（VIII)的化合物可以通过使用单保护哌嗪作为胺接着进行脱保 护步骤来获得。
[0292] 还可使用无环仲胺例如二乙胺和二异丙胺，但环状仲胺是优选的。
[0293] 异丁醛和乙醛的这种反应模式不同于直接的碱催化反应（例如使用碳酸钾作为 碱：英国专利GB834100)，其仅产生其中异丁醛用作亲核体的加合物2, 2-二甲基-3-羟基 丁醛。
[0294]
[0295] 不希望受任何具体理论的束缚，假设乙醛和异丁醛两者最初被转化为它们的烯胺 衍生物。在酸催化剂的存在下，更加碱性的异丁烯胺被转化成其亚胺离子。该亲电子物质 优先与较少空间位阻的亲核体（其为乙醛烯胺）反应-这确保反应围绕期望的方式进行。
[0296]
[0297] 本发明的方法比实现正常乙醛反应性的这种"极反转"的文献方法更经济并且更 适合于按比例放大，在文献方法中乙醛被转化为0-甲烷硅基化烯醇衍生物并与异丁醛在 Mukiyama羟醛条件下偶联。在本发明中，两种偶联配偶体被同时活化-电子和空间效应，指 导所观察到的反应性模式。另一优点是，产物二烯胺是4-甲基-2-戊烯醛用于与乙醛酸反 应以形成所需的5-氨基呋喃酮（VII)的期望的"活化"形式。
[0298] 这些式（VIII)的二烯胺衍生物可被分离和纯化，或可选择地它们可以直接用乙 醛酸（或其水合物）处理，这直接提供呋喃酮衍生物（VII)。
[0299] 呋喃酮衍生物（VII)可被分离和纯化。随后使用酸水溶液的处理提供呋喃酮 (VI A)。
[0300] 总体而言，上文示出的转化提供了用于使用廉价且安全的起始材料制备普瑞巴林 的短路径。
[0301] 在可选择的实施方式中，二氢呋喃酮（I)从3-亚异丁基-2-氧代戊二酸（XII)制 备，所述（XII)由异丁醛与2-氧代戊二酸（a-酮戊二酸）（XIV)的缩合容易地获得。
[0302]
[0303] 二酸（XII)至二氢呋喃酮（I)的转化需要脱羧步骤和还原步骤。这两个处理步骤 可以分开进行，在这种情况下脱羧步骤或还原步骤可以是第一步骤，或者这两个过程可同 时进行。当还原步骤首先进行时，将产生中间体（XV)。当脱羧步骤首先进行时，将产生中间 体（XVI)。
[0304]
[0305] 还原步骤可化学地进行，例如通过氢化，但优选使用酶介导的还原例如通过用烯 酮还原酶处理来实现。脱羧步骤优选通过用脱羧酶处理化合物来进行。
[0306] 当实施酶介导的转化时，所述酶可以是分离的酶，包括固定在载体上的酶，其可以 是部分分离的酶制剂例如细胞匀浆，或者其可以是非分离的酶，在该情况下使用全细胞制 备物。细胞可包括天然表达所需的酶的细胞和已被操纵以便表达所需的酶的细胞。
[0307] 式（IA)的化合物的酶介导的还原性胺化是可逆的，因此用转氨酶或胺氧化酶/亚 胺还原酶对3-氨甲基-5-甲基己酸（II)的处理可导致形成二氢呋喃酮（I A)。该化合物的开 环异构体是化合物（IB)，其是可差向异构化的。鉴于此，可能的是使用这样的酶将（(R)-II) 转化为（(S)-II)或者增加（(R)-II)和（(S)-II)的混合物的光学纯度。
[0308]
实施例
[0309] 本发明通过其中使用下列缩写和定义的下列非限制性实施例举例说明：
[0310] bp 沸点
[0311] CPME环戊基甲醚
[0312] d 双峰
[0313] DIW 去离子水
[0314] dd 双二重峰
[0315] eq or eq. 当量
[0316] e. e. or ee 对映体过量
[0317] ES+正模式电喷雾电离
[0318] EtOAc乙酸乙酯
[0319] EtOH乙醇
[0320] GC 气相色谱
[0321] GC/MS气相色谱/质谱
[0322] HOAc 乙酸
[0323] HPLC 高效液相色谱法
[0324] Hr或h 小时
[0325] 'H NMR 质子核磁共振波谱
[0326] L 升
[0327] LCMS液相色谱/质谱
[0328] M 多重峰
[0329] mbar 毫巴
[0330] MeOH 甲醇
[0331] min 分钟
[0332] mL 毫升
[0333] mmol 毫摩尔
[0334] mol 摩尔
[0335] Mp 熔点
[0336] MTBE 甲基叔丁基醚
[0337] NAD+ 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化的）
[0338] NADP+ 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化的）
[0339] NADH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原的）
[0340] NADPH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原的）
[0341] PLP 磷酸吡哆醛
[0342] ppm 百万分率
[0343] pTsOH 对甲苯磺酸