噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物及其用图
【专利说明】噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物及其用途
[0001 ] 关于联邦资助研究或开发的声明
[0002] 本发明根据由国立卫生研究院（National Institutes of Health)颁发的 AA020090和CA016954在政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。 发明领域
[0003] 本发明属于药物化学领域。具体来说，本发明涉及噻吩并吡啶化合物的混合二硫 键缀合物（mixed disulfide conjugate)以及它们作为用于治疗、改善和预防心血管疾病 的治疗剂的用途。
[0004] 引言
[0005] 噻吩并吡啶基化合物广泛用作用以预防心脏病发作和中风的抗血小板剂。在这个 类别中，氯吡格雷（clopidogrel)(波立维（Plavix))、噻氯匹定（ticlopidine)(抵克立得 (Ticlid))和普拉格雷（prasugrel)(伊芬特（Effient))是三种通常使用的前药。这些药 剂要求多态性细胞色素（P450)介导的氧化性生物活化。所述氧化性生物活化导致缓慢开 始治疗作用和若干不利作用，包括嗜中性白细胞减少症和血栓性血小板减少性紫癜。
[0006] 需要不要求多态性细胞色素（P450)介导的氧化性生物活化的改进抗血小板剂。
[0007] 发明概述
[0008] 氯吡格雷（波立维）、噻氯匹定（抵克立得）和普拉格雷（伊芬特）属于一类广泛 用作用以预防心脏病发作和中风的抗血小板剂的噻吩并吡啶基化合物。然而，若干严重缺 点已与这些药物相关联，包括缺乏反应、毒性和过度出血。这些缺点与它们都是要求由多态 性细胞色素P450酶（P450)进行氧化性生物活化的前药的事实密切相关。
[0009] 为克服与噻吩并吡啶化合物（氯吡格雷（波立维）、噻氯匹定（抵克立得）和普 拉格雷（伊芬特））相关的缺点，开发了噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。实际上， 在开发本发明的实施方案的过程期间进行的实验证明本发明的噻吩并吡啶化合物的混合 二硫键缀合物能够在内源性谷胱甘肽（GSH)存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物（例如能够 具有抗血小板活性的活性噻吩并吡啶代谢物）而不需要由P450进行生物活化。这个方法 不仅绕过由P450达成的氧化性生物活化过程，而且规避与噻吩并吡啶基药物相关的许多 缺点。举例来说，因为自缀合物产生活性代谢物是可预测的，所以本发明的噻吩并吡啶化合 物的混合二硫键缀合物使给药一致性改进。此外，使用本发明的噻吩并吡啶化合物的混合 二硫键缀合物作为抗血小板剂使毒性降低，因为不通过巯基交换反应产生毒性反应性代谢 物。此外，本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的治疗起效时间缩短，此使经历 急性心血管事件的患者极大受益。举例来说，噻吩并吡啶的标准方案要求对患者连续给药 3-5天，因为仅较小百分比的摄取噻吩并吡啶被转化成活性代谢物。相比之下，本发明的噻 吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物在少于30min内以高产率释放活性代谢物。此外，本 发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物具有超过活性代谢物的优越稳定性，并且因 此它们可用于定量产生活性代谢物以供在体外进行基础和临床研究。
[0010] 因此，在某些实施方案中，本发明提供噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物，其 能够克服与广泛用作抗血小板剂的噻吩并吡啶基化合物（例如氯吡格雷（波立维）、噻氯匹 定（抵克立得）和普拉格雷（伊芬特））相关的所述缺点。本发明不限于噻吩并吡啶化合物 的特定混合二硫键缀合物。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物被 描述为式I
包括其药学上可接受的盐、溶剂合物和/或 前药；其中R1、R2和R3独立地包括使得所得化合物能够在与内源性谷胱甘肽（GSH)相互作 用后产生活性噻吩并吡啶代谢物（例如能够具有抗血小板活性的活性噻吩并吡啶代谢物） 的任何化学部分。
[0011] 在某一实施方案中，R1选自由以下组成的组：H、-C0-0CH3和
[0012] 在一些实施方案中，R3是氯或氟。
[0013] 在一些实施方案中，R2选自由以下组成的组：
和
[0014] 在某些实施方案中，本发明提供包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物以及 药学上可接受的载体的药物组合物。
[0015] 在某些实施方案中，本发明提供经配制以供静脉内（IV)施用的包含噻吩并吡啶 化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物。在一些实施方案中，所述经配制以供静脉内 (IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物用于治疗、改善和预 防动脉粥样硬化血栓形成。在一些实施方案中，所述经配制以供静脉内（IV)施用的包含噻 吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物用于快速抑制血小板聚集。在一些实 施方案中，所述经配制以供静脉内（IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合 物的药物组合物在经皮冠脉干预程序（例如冠脉血管成形术）期间用于快速抑制血小板聚 集。
[0016] 在某些实施方案中，本发明提供治疗、改善或预防心血管疾病的方法，其包括向患 者施用治疗有效量的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。在一些实施方案中，所述施 用是静脉内施用。在一些实施方案中，心血管疾病选自由以下组成的组：冠状动脉疾病、外 周血管疾病和脑血管疾病。在一些实施方案中，化合物使血小板聚集降低（例如通过不可 逆结合P2Y 12受体）（例如通过阻断ADP受体）。在一些实施方案中，化合物能够在内源性谷 胱甘肽存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物而不需要由P450进行生物活化。在一些实施方 案中，所述方法进一步包括共同施用至少一种选自由以下组成的组的物质：HMG-C 〇A还原 酶抑制剂、ACE抑制剂、钙通道阻断剂、血小板聚集抑制剂、多不饱和脂肪酸、纤维酸（Fibric Acid)衍生物、胆汁酸螯合剂、抗氧化剂和抗心绞痛剂。
[0017] 在某些实施方案中，本发明提供治疗、改善或预防患者的血小板于血管上聚集的 方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。在一 些实施方案中，所述施用是静脉内施用。在一些实施方案中，所述患者具有发生心血管疾病 (例如冠状动脉疾病、外周血管疾病和脑血管疾病）的风险或处于所述风险下。在一些实施 方案中，治疗、改善或预防血小板聚集是通过不可逆结合P2Y 12受体而发生。在一些实施方 案中，治疗、改善或预防血小板聚集是通过阻断ADP受体而发生。在一些实施方案中，噻吩 并吡啶化合物的混合二硫键缀合物能够在内源性谷胱甘肽存在下产生活性噻吩并吡啶代 谢物而不需要由P450进行生物活化。
[0018]附图简述
[0019] 图1显示硫醇还原剂对形成氯吡格雷的活性代谢物（AM)的影响。在0. 1ml 50mM KP缓冲液（pH 7. 4)中产生AM，所述缓冲液含有0. 2mg/ml HLM、0.1 mM 2-氧代氯吡格雷、 NADPH再生系统和硫醇还原剂。除各自是0. 3mM的CPT、DFT和NPT之外，硫醇还原剂的浓 度是ImM。通过添加5单位G6H)来引发反应，并且在37°C下孵育20min。接着如材料和方 法中所述，以MP衍生物形式定量活性代谢物。报道的速率是对三个单独测量结果的平均。 硫醇化合物的缩写提供于表1中。
[0020] 图2显示氯吡格雷的代表性混合二硫键缀合物的提取离子色谱图（EIC)。在37°C 下持续30min在0. 2ml 50mM KPi缓冲液（pH 7. 4)中产生混合二硫键缀合物，所述缓冲液 含有lmg/ml HLM、0.1 mM 2-氧代氯吡格雷、各种硫醇还原剂和NADPH再生系统。如材料和 方法中所述进行MS分析。（A)，在m/z 432. 06下的BME缀合物的EIC ; (B)在m/z 482. 08 下的DFT缀合物的EIC ; (C)在m/z 499. 99下的CPT缀合物的EIC ; (D)在m/z 510. 08下的 NPT缀合物的EIC。
[0021] 图3显示由HLM产生的AM和氯吡格雷的硫醇缀合物的相对量。在0. 2ml 50mM KP (pH 7. 4)中产生AM和缀合物，如图2中所述。对于这些分析，将50皮摩尔（S)_氯吡格 雷外加至各样本中作为IS。如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS以依赖性扫描模式分析 AM与硫醇缀合物两者。图例：空心棒条，m/z 356 (AM)与m/z 322 (IS)的AUC比率；实心棒 条，相应缀合物与IS的AUC比率。
[0022] 图4显示CPT的混合二硫键缀合物的MS和MS2光谱。如图2中所述产生缀合物。 如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS以依赖性扫描模式获得MS和MS 2光谱。（A) CPT缀合 物的MS光谱；(B) CPT缀合物的母离子m/z 499. 99的MS2光谱；(C)，CPT缀合物的母离子m/ z 501. 94的MS2光谱；(D)，对图4B中所示的碎裂样式的指定。
[0023] 图5显示由GSH还原氯吡格雷的混合二硫键缀合物的动力学。自含有lmg/ml HLM、 0.1 mM 2-氧代氯吡格雷、NADPH再生系统和各种硫醇还原剂的反应混合物制备混合二硫键 缀合物，并且使用SPE C18柱进行纯化，如材料和方法中所述。接着混合纯化的缀合物与 ImM GSH和0. 2mg/ml胞质溶胶（当存在时）。使用LC-MS/MS分析剩余的缀合物和形成的 AM。图例：(A)在0. 2mg/ml胞质溶胶存在下由ImM GSH还原BME (〇）、CPT ( )、NAC ( ▼ )、DFT( ▲)和NPT( □)的缀合物。（B)在存在和不存在0? 2mg/ml胞质溶胶下由ImM GSH 还原CPT缀合物。图例：（〇），在不存在胞质溶胶下的AM形成；（A )，在存在胞质溶胶下 的AM形成；（鲁），在不存在胞质溶胶下的缀合物还原；（▲)，在存在胞质溶胶下的缀合物 还原。实线和虚线是相对于单一指数函数的非线性曲线拟合。
[0024] 图6显示观察的在m/z 504下的提取离子色谱图，其显示自氯吡格雷的混合二硫 键缀合物形成活性代谢物H4。在HLM中产生混合二硫键缀合物，并且用SPE柱纯化，如图3 中所述。在MS分析之前，混合二硫键缀合物用DTT处理以释放AM，其接着随后用MPB衍生。 如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS分析AM-MP衍生物。图例：A，反式-氯吡格雷-MP (虚 线）和顺式-氯吡格雷-MP (实线）标准物；B，在ImM GSH (虚线）和ImM抗坏血酸（实线） 存在下获得的AM-MP ;C，由CPT缀合物获得的AM-MP ;D，由NPT缀合物获得的AM-MP ;E，由 DFT缀合物获得的AM-MP。幅值被乘以2。
[0025] 图7显示由氯吡格雷的混合二硫键缀合物抑制血小板聚集。在0.3mM CPT和NPT 存在下，自反应混合物制备并纯化混合二硫键缀合物，连同三个对照样本含有ImM GSH、不 含有硫醇还原剂或不含有G6ro。将所有样本都再混悬于0. 5ml PPP中，其中一些用ImM GSH 处理以释放AM。通过添加10 iiMADP来引发血小板聚集，并且用聚集计进行记录。相对于 PRP的聚集百分比使聚集百分比标准化，并且对四个单独测量结果取平均值。关于细节参见 材料和方法。图例：PRP，未处理的富含血小板血浆；GSH，含ImM GSH的PRP ;-G6PD，在不存 在G6H)下产生的代谢物；-SH，在不存在任何硫醇还原剂下产生的代谢物；GSH，在存在ImM GSH下产生的代谢物；CPT，在存在0. 3mM CPT下产生的代谢物；CPT+GSH，在存在0. 3mM CPT 下产生，接着用ImM GSH处理的代谢物；NPT，在存在0. 3mM NPT下产生的代谢物；NPT+GSH， 在存在0. 3mM NPT下产生，接着用ImM GSH处理的代谢物。
[0026] 图8呈现如实施例X中所述，在重构系统中生物合成的纯（S)-clopNPT的总离子 色谱图。在7. 9、8. 6和9. 5min洗脱（S)-clopNPT的三种非对映异构体。
[0027] 图9呈现如实施例X中所述，雄性NZ白兔在静脉内注射（S) -clopNPT之后的血小 板活性。
[0028] 定义
[0029] 如本文所用的术语"噻吩并吡啶化合物"是指因其抗血小板活性而被使用的一类 ADP受体/P2Y12抑制剂。实例包括但不限于氯吡格雷（波立维）、噻氯匹定（抵克立得） 和普拉格雷（伊芬特）。
[0030] 如本文所用的术语"噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物"是指能够在与内源 性谷胱甘肽（GSH)相互作用后产生活性噻吩并吡啶代谢物的改性噻吩并吡啶化合物。
[0031] 如本文所用的术语"前药"是指母体"药物"分子的药理学无活性衍生物，其要求 在目标生理系统内进行生物转化（例如自发或酶促生物转化）以释放活性药物或使前药转 化（例如以酶促方式、以生理方式、以机械方式、以电磁方式）成活性药物。前药被设计来 克服与稳定性、水溶性、毒性、缺乏特