围内的是在某些情况下，增加 GM-CSF或将（全部或部分）GM-CSF用TLR激动剂和⑶40配体的至少一种替换是可行的。
[0159] 采用免疫细胞化学方法，测定在黑素瘤系中表达的一组抗原的表达。简单地说， 在1000IU/mLIFN-c存在或不存在时，将细胞在8室培养载玻片（ThermoFisher)中培养。 72小时后，细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS)洗涤3次，并在冷的丙酮中固定。在封闭内源过 氧化物酶后，将细胞与针对所列抗原的合适的第一抗体一起孵育。使用生物素化抗小鼠或 兔免疫球蛋白，超敏感酶（SuperSensitiveenzyme)缀合的链霉抗生物素标记和辣根过 氧化物酶色原和底物试剂盒（Biogenex，Fremont，CA)，进行免疫组织化学。用同种型匹配 的对照抗体研究了下列抗人多克隆或单克隆抗体的反应性：S-100和HMB-45 (Biogenex)、 Mel-2、Mel-5、Mart-l(Signet)、酪氨酸酶、Mage-1(ThermoScientific,Waltham,MA)、 Melan-A、HLAI类和HLAII类（Dako,Carpinteria，CA) 〇
[0160] 方法2.癌细胞系纯化的癌干细胞球状体方法 通过解剖刀切碎和胶原酶消化，对手术肿瘤样品进行处理。将所得细胞悬液以5-20万 个细胞/mL置于超低贴壁细胞培养瓶（Corning)中的神经元干细胞培养基（成神经干细胞 培养基，CaliforniaStemCell,Irvine,CA)中21天。在超低粘附基质中培养期间，bFGF 不是绝对需要的，然而，bFGF促进更快速的增殖。本公开内容提供细胞群、球体群和相关方 法，其中在超低粘附基质中培养期间不使用bFGF，和其中在超低粘附基质中培养期间实际 上还包括bFGF。每隔2-3天，使用沉降回收肿瘤干细胞球体，在新鲜培养基中重新培养。在 21天球形体培养期后，球体用酶促的胰蛋白酶消化分离，得到单细胞的悬液。然后将细胞置 于标准细胞培养瓶（Corning，Corning，NY)中含有15%胎牛血清的RPMI培养基或不含动物 产品的扩增培养基（OmegaScientific，Tarzana，CA)中，扩增以建立增殖的贴壁细胞培养 物。可以使用提供足够营养物的其它扩增培养基配方以确保贴壁癌细胞群的快速扩增。
[0161] 在从深低温保藏中融化后或在细胞培养期间，通过流式细胞术，针对以下一种或 多种的表达，对纯化的肿瘤细胞培养物、癌干细胞球状体和酶消化样品进行测定：MHCI类、 MHCII类和CD146 和CD271(BDBiosciences，SanJose，CA)。另外，还测定了正常人真皮 成纤维细胞的对照样品。将细胞在4%低聚甲醛（Sigma-Aldrich,St.Louis,M0)中固定 15分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS)(OmegaScientific)洗涤两次，以100万个细胞/毫升 重新悬浮。细胞用10uLCD146和CD271或同种型对照（BDBiosciences)染色30分钟， 用PBS洗涤，并按照制备说明书，在珠粒标准化的FACSCalibur(BDBiosciences)上进行 流式细胞术。
[0162] 在细胞扩增示例性实施中，进行程序的细胞为约1个细胞、正好1个细胞、约10个 细胞、约20个细胞、约50个细胞、100个细胞、约1，000个细胞、约2, 000个细胞、约5, 000个 细胞、约10, 〇〇〇个细胞、约20, 000个细胞、约50, 000个细胞、约100, 000个细胞、约200, 000 个细胞、约500, 000个细胞、约1X106个细胞、约2X10 6个细胞、约5X10 6个细胞、约10 X106个细胞、约20X10 6个细胞、约50X10 6个细胞、约100X10 6个细胞、约200X10 6 个细胞、约500X106个细胞、约1x10 9个细胞、约2X10 9个细胞、约5X10 9个细胞、约 10x109个细胞、约20x10 9个细胞、约50x10 9个细胞、约100x10 9细胞等。
[0163] 在某些情况下，可能有用的是将下列步骤的一个或多个添加到方法2。血浆处理的 组织培养瓶上的贴壁步骤，基本上紧接肿瘤的酶消化，接着洗涤步骤以除去未粘附在培养 瓶上的淋巴细胞和碎片。孵育步骤，其中洗涤步骤之后可为在神经元干细胞培养基中孵育 癌细胞和正常细胞的贴壁混合物，这可从培养瓶表面产生癌干细胞球体的芽。收集步骤，其 中可收集出芽的癌干细胞，并置于超低贴壁条件下用于进一步增殖。
[0164] 改进的方法2.癌细胞系纯化的癌干细胞球状体方法 下列非限制性方案是用于处理和表征通过微球体技术产生的肿瘤细胞系。下面公开了 微球体技术。
[0165] 步骤1.随机选择8个酶促消化的黑素瘤肿瘤样品。
[0166] 步骤2.将冷冻小瓶在设置为37°C的水浴中融化，得到细胞悬液。将悬液滴加到 含有5%RPMI培养基的15mL圆锥管中。
[0167] 步骤3.以1200rpm离心5分钟。
[0168] 步骤4.重新悬浮于10mL的成神经细胞培养基中。
[0169] 步骤5.使用血细胞计数器进行细胞计数和存活力测试。
[0170] 步骤6?以80, 000个活细胞/mL重新悬浮于Neuroplast加10ng/mLbFGF中，并 以0. 52ml/平方厘米置于超低粘附培养瓶中。
[0171] 步骤7.每2-3天，细胞以900rpm离心5分钟，并用新鲜培养基更换。对于前3次 培养基更换重复该步骤，然后对于共21天的剩余培养期，改为被动沉降。被动沉降包括将 细胞悬液转移到50mL圆锥管中，将夹具中的圆锥管置于平坦表面3-5分钟。观察圆锥管底 部以收集微球体。除去上清液，将细胞沉淀重新悬浮在补充10ng/mLbFGF的Neuroblast 加5%FBS中。在21天结束时，进行被动沉降。
[0172] 步骤8.除去上清液，轻轻吸放的同时，用TrypLE分离细胞沉淀10分钟。使用血 细胞计数器进行细胞计数，并评价存活力。
[0173] 步骤9.以20, 000-30, 000个活细胞/平方厘米将细胞悬浮于标准贴壁细胞培养 瓶中的补充10ng/mLbFGF的Neuroblast加5%FBS中。保持细胞培养3-4周，同时每周 更换培养基2-3次，这取决于培养基的使用。定期拍摄相衬照片。
[0174] 步骤10.在扩增期结束时，将细胞用TrypLE传代，并进行细胞计数。
[0175] 步骤11.可如下表征来自所制备的细胞的样品。通过在低聚甲醛固定液中孵育将 300-500万个细胞固定，对于流式细胞术表征，使用针对⑶146和⑶271的抗体。细胞还用 同种型lgGl-PE和IgGI-FITC、CD146-PE和CD271-FITC标记的抗体在室温下在PBS中避光 染色30分钟。染色的细胞以400xg离心5分钟，用PBS洗涤一次。然后将细胞重新悬浮 于0. 4mLPBS中，并用于BDFACSCalibur?仪器中的流式细胞术。
[0176] 给予受试者 皮下（SC)给予树突细胞疫苗。各剂量的范围为500-2000万加载的DC，以一系列8剂 重复。第一个月每周给予注射（4次），在接下来4次注射后每月给予。在备选的示例性实 施中，给药一周一次达3周，然后一月一次为期5个月，共8周。在一些示例性的实施中，与 每剂一起同时给予加强佐剂（GM-CSF)。在备选的示例性实施中，给予GM-CSF加强佐剂，但 不与每个单剂量一起给予。在其它示例性的实施中，完全没有GM-CSF加强佐剂。
[0177] 无限制地，将树突细胞（例如自体或同种异体树突细胞）与作为细胞裂解物、酸 洗脱液、细胞提取物、部分纯化的抗原、纯化的抗原、分离的抗原、部分纯化的肽、纯化的肽、 分离的肽、合成肽或其任何组合的癌干细胞抗原接触。然后将树突细胞给予受试者，例如， 带有癌的受试者或未带有癌的对照受试者。在示例性的实施中，通过皮下、结节内、肌内、 静脉内、鼻内、吸入、口服的一种或多种途径、通过施用于肠腔等，与树突细胞接触、注射或 给予树突细胞（参见例如 〇'Neill等（2004)Blood. 104:2235-2246;Sabado和Bhardwaj (2010)Immunotherapy. 2:37-56)。
[0178] 因此，虽然如应用于示例性实施和/或其方面一样，显示、描述和指出本公开内容 的基本的新特征，但应了解在不偏离本公开内容和/或权利要求书的精神的情况下，本领 域技术人员可在示例性实施、公开内容和其方面的形式和详细资料中进行各种省略、重新 配置和取代及变化。例如，明确预期，以基本相同的方式执行基本相同的功能以实现相同结 果的所述要素和/或方法步骤的所有组合都在本公开内容的范围内。此外，应认识到，结合 任何公开的形式或实施所显示和/或描述的结构和/或要素和/或方法步骤可并入任何其 它公开或描述或提议的形式或实施作为设计选择的普通题材。因此意图是不限制本公开内 容的范围。预期所有这样的修饰在此都在随附权利要求书的范围内。
[0179] 本说明书中引用的所有出版物、专利、专利申请和参考文献通过引用结合到本文 中，就像在本文完全给出一样。
[0180]虽然通过目前被认为是最实用和优选的实施、范例和/或实施方案描述了方法和 仪器，但要了解，本公开内容不必限于所公开的实施、范例和/或实施方案。预期涵盖包括 在权利要求书的精神和范围内的各种修改和类似安排，权利要求书的范围应符合最宽泛的 诠释以包括所有这样的修改和类似结构。
[0181]还应理解，可在不偏离本发明的本质的情况下进行多种改变。所述变化也明确包 括在本说明书中。它们仍落入本公开内容的范围内。应理解，本公开内容意欲产生独立地 和作为整体系统以及在方法和仪器方式两者中涵盖多个方面的专利。
[0182]此外，本公开内容、范例、其方面和权利要求书的不同要素的每一个也可以多种方 式实现。本公开内容应理解为包括各个所述变化是任何仪器、方法或过程的变化，或甚至只 是这些的任何要素的变化。
[0183]尤其应理解，因为本公开内容涉及要求保护的要素，各要素的措词可通过等同的 仪器术语或方法术语表示一甚至只要功能或结果相同。
[0184]所述等同、较宽泛或甚至更通用的术语应视为包括在各要素或操作的描述中。在 需要使本发明对其享有权利的绝对宽大的覆盖范围明确时，所述术语可被替换。
[0185]应理解，所有操作都可表示为采取该操作的手段或表示为引起该操作的要素。
[0186]同样，所公开的各个物理要素应理解为包括该物理要素促进的操作的公开。
[0187]本专利申请提及的任何专利、出版物或其它参考文献均通过引用结合到本文中。
[0188]最后，信息披露声明或其它信息声明所列举的所有参考文献随本申请提交或之后 予以附加和通过引用予以结合；然而，至于上面的每一个，就通过引用结合的所述信息或声 明可能被视为与对所要求保护的发明申请专利不一致的方面来说，所述声明明确不视为由 本申请人所作。
[0189]在这一方面，应理解出于实践理由且为了避免增加可能的数百个权项，本申请人 只提供具有初始从属性（initialdependencies)的权项。
[0190]应理解，支持存在至在新的主题法规一一包括但不限于35USC§ 132或其它所述 法规一一下所要求的程度，以允许加入在一个独立权项或构思下呈现的不同附属性或其它 要素的任一个作为任何其它独立权项或构思下的附属性或要素。
[0191]就所进行的非实质替换而言，就本申请人实际上没有草拟任何权项使得字面上包 括任何具体的实施方案而言，且就以别的方式可适用而言，不应认为本申请人以任何方式 预期或实际上放弃所述覆盖范围，因为本申请人仅可能不能够预测所有的不测事件；不应 理当预期本领域的技术人员草拟字面上将包括所述备选实施方案的权利要求。
[0192]此外，按照传统权项诠释，过渡性词语"包含"的使用在本文被用来保持"开放式" 权利要求。因此，除非文中另有要求，否则应理解术语"包含"或变化形式例如"包括"或"具 有"仅欲指包括规定的要素或步骤或要素类或步骤类，但不排除任何其它要素或步骤或要 素类或步骤类。
[0193]所述术语应以其最扩展的方式解释，以便提供本申请人法律上允许的最广泛的覆 盖范围。
[0194] 提供遵从37CFR§ 1 .72(b)的发明摘要，以供读者快速查明技术公开内容的性 质和主旨。要理解，发明摘要以不用于解释或限制权利权利要求书的范围或含义的方式提
【主权项】
1. 一种来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中： (i) 所述群中至少30%的细胞表达⑶146,且所述群中至少30%的细胞表达⑶271，或 (ii) 其中至少30%的细胞共表达⑶146和⑶271，其中百分比值（%)定义为相对于所 述群的平均值。2. 权利要求1的分离的细胞群，其中： 表达为至少35% ;和 共表达为至少35%。3. 权利要求1的分离的细胞群，其中： 表达为至少40% ;和 共表达为至少40%。4. 权利要求1的分离的细胞群，其中： 表达为至少45% ;和 共表达为至少45%。5. 权利要求1的分离的细胞群，其中： 表达为至少50% ;和 共表达为至少50%。6. 权利要求1的分离的细胞群，其中低于5%的细胞是污染细胞。7. 权利要求1的分离的细胞群，其中低于2%的细胞是污染细胞。8. -种包含自体树突细胞的疫苗，其中所述树突细胞加载了权利要求1的分离的细胞 群，且其中所述树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。9. 一种包含自体树突细胞的疫苗，其中所述树突细胞加载了权利要求5的分离的细胞 群的至少一种，且其中所述树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。10. 权利要求8的疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，所述细胞群包含防止细胞分 裂的辐射损伤，或包含防止细胞分裂的核酸交联剂。11. 一种来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达 ⑶146,至少30%的细胞表达⑶271，或 其中至少30%的细胞共表达⑶146和⑶271， 其中所述细胞通过包括以下步骤的方法制备： 步骤i.将黑素瘤肿瘤样品中的细胞分散， 步骤ii.在低粘附表面或超低粘附表面上培养， 步骤iii.沉降以收集微球体；和 步骤iv.将细胞从微球体中分离。12. 权利要求11的细胞，所述方法还包括为了扩增细胞在培养基中在粘附表面上培养 以产生扩增细胞群的步骤（步骤V)。13. 权利要求11的细胞，其中与在步骤i的细胞中是可检出的表达相比，所述分离的细 胞群具有以下的至少一种： (i) 减量调节的免疫抑制分子； (ii) 增量调节的MHC-II ;或 (iii) 减量调节的免疫抑制分子和增量调节的MHC-II。14. 权利要求12的细胞，其中与在步骤i的细胞中是可检出的表达相比，所述分离的细 胞群具有以下的至少一种： (i) 减量调节的免疫抑制分子； (ii) 增量调节的MHC-II ;或 (iii) 减量调节的免疫抑制分子和增量调节的MHC-II。15. 权利要求12的细胞，其中所述免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯-2, 3-双加氧酶、月中 瘤生长因子-P和白介素-10 (IL-IO)的至少一种，且其中与在步骤i中是可检出的表达 (定义为100%)相比，减量调节是至80%或更低的水平。16. 权利要求11的细胞，其中将细胞从黑素瘤肿瘤样品和微球体的一种或两种中分散 包括用添加的蛋白酶处理。17. 权利要求11的细胞，其中在低粘附表面或超低粘附表面上的培养是在碱性成纤维 细胞生长因子（bFGF)存在下。18. 权利要求12的细胞，其中为了扩增细胞在粘附表面上的培养是在含有bFGF的培养 基中。19. 权利要求11的细胞，其中在低粘附表面或超低粘附表面上的培养包括收集已经形 成的任何肿瘤干细胞球体，其中所述收集每隔2-3天进行，将所收集的球体在新鲜培养基 中在低粘附表面上恢复培养。20. 权利要求12的细胞，其中在粘附表面上培养的总时间选自为12-30天、14-28天或 18-24天的期限。21. -种包含加载权利要求11的分离细胞群的自体树突细胞的疫苗，其中所述树突细 胞和人肿瘤来自同一人类受试者。22. -种包含加载权利要求12的分离细胞群的自体树突细胞的疫苗，其中所述树突细 胞和人肿瘤来自同一人类受试者。23. 权利要求21的疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，通过照射肿瘤细胞或通过将 核酸交联剂加入肿瘤细胞中，来防止肿瘤细胞分裂。24. -种用于刺激针对一种或多种黑素瘤特异性抗原的抗原特异性免疫应答的方法， 所述方法包括给予包含活的黑素瘤细胞的人类受试者 包含加载了权利要求11的分离细胞群的自体树突细胞的疫苗， 其中所述树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。25. 权利要求24的方法，其中所述黑素瘤特异性抗原是MGE抗原。26. -种用于产生纯化的癌干细胞的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 将之前通过分离肿瘤样品的细胞而获得的细胞悬液浸入神经元干细胞培养基中 和在低粘附或超低粘附容器中培养； (b) 允许癌干细胞球体形成； (c) 通过沉降回收癌干细胞球体以产生回收的球体； (d) 将回收的球体重新培养； (e) 在所述重新培养期间允许回收的球体彼此缔合； (f) 使缔合的球体分离以产生单细胞悬液。27. 权利要求26的方法，所述方法还包括在分离肿瘤样品以产生细胞悬液的步骤之前 获得肿瘤样品的步骤。28. 权利要求26的方法，所述方法还包括建立增殖性贴壁细胞培养物并扩增细胞的步 骤。29. 权利要求11的方法，其中步骤（ii)培养不在低粘附表面上。30. 权利要求11的方法，其中步骤（ii)培养在超低粘附表面上。
【专利摘要】本公开内容提供可用于给予患有肿瘤性病症的受试者的试剂(包括细胞)和相关方法。所述试剂和方法包括纯度提高的癌干细胞。肿瘤性病症包括黑素瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌和肺癌。
【IPC分类】C12N5/078, C12N5/095, A61K39/00
【公开号】CN105051187
【申请号】CN201380053912
【发明人】A.科恩富思, M.麦克加里
【申请人】新干细胞肿瘤学有限责任公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2013年8月6日
【公告号】CA2882095A1, EP2885403A1, US20150238586, WO2014028274A1