使得基本上所有的污染物和感兴趣的多 核苷酸从离子交换树脂洗脱。一般，再生缓冲液具有非常高的盐浓度，以从离子交换树脂洗 脱污染物和片段。
[0105] 例如，本发明的一些实施方案包括使样品经受阴离子交换色谱。可以如通过引 用并入本文的Ausser，W.A.等人，^High-resolutionanalysisandpurification ofsyntheticoligonucleotideswithstronganion-exchangeHPLC"，BI0TECHNIQU ES，19:136-139(1995)所述进行核苷酸片段的高分离度分析。对于阴离子交换树脂，共 价连接至基质的荷电基团可以是例如二乙基氨基乙基（DEAE)、季氨基乙基（QAE)和/或 季铵（Q)。在一些实施方案中，采用的阴离子交换树脂是QSepharose柱。例如，可以 使用例如QSepharose?FastFlow、QSepharose?HighPerformance、QSepharose? XL、Capto?Q、DEAE、T0Y0PEARLCHg媒福5:Q、Fractogel?TMAE(trimethylamino ethyl、aquarternaryammoniaresin)、Eshmuno?Q、Nuvia?Q或UNOsphere?Q进行 阴离子交换色谱。可以在本发明范围内使用其他阴离子交换剂，包括但不限于季胺树脂 或"Q-树脂"（例如，Capt〇?-Q、Q-SepharoseK,QAESephadex'K );二乙基氨基乙烷 树脂（例如，DEAE-Trisaieril'DEAESepharose?、.苯甲酰化萘甲酰化DEAE、二乙基 氨基乙基Sephacel?) ;Amberjet:'K3树脂；Amber丨yst"树脂；Amber Iite、树脂（例如，Amberlit_e?:IRA- 67、Amberlite?强碱性、Amberlite? 弱碱性）、消胆胺树脂、ProPac? 树脂（例如，ProPa#SAX- 10、pr〇:P_?WAX- 10、Pr〇PacH we'X- 10) ;TSK-.GELK> 树脂（例如，TSKgelDEAE-NPR;TSKgelDEAE-5PW);和AcclaimK树脂。
[0106] 阴离子交换色谱的典型流动相包括相对极性溶液，例如水，乙腈，有机醇例如甲 醇、乙醇和异丙醇，或含有2-(N-吗啉代）-乙磺酸（MES)的溶液。因此，在某些实施方案中， 流动相包括约 0%、1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或约100%极 性溶液。在某些实施方案中，在分离过程期间任何给定时间，流动相包括约1%至约100%、 约5%至约95%、约10%至约90%、约20%至约80%、约30%至约70%或约40%至约60% 极性溶液。
[0107] 在一些实施方案中，使样品经受阳离子交换色谱，例如磺丙基（SP)阳离子交换 色谱。在一个典型实施方案中，阳离子交换色谱包括磺丙基（SP)阳离子交换色谱，但 是可以使用其他阳离子色谱膜或树脂，例如MUSTANG?S膜、S-S印harose?树脂或Blue Sepharose?树脂。可以在优化的温度下进行阳离子交换色谱以增强靶结合和/或减少杂 质结合。
[0108] 在一些实施方案中，使样品经受疏水相互作用色谱（HIC)。疏水相互作用色谱利用 给定分子对极性或非极性环境的吸引，就核酸而言，该倾向由核苷酸及其上修饰的疏水性 或亲水性决定。因此，基于其对疏水基质的不同程度吸引而分级分离核酸，所述疏水基质通 常是具有链长为2 - 18个碳的烷基连接体臂的惰性支持体。固定相由连接至亲水聚合物骨 架（例如，交联Sepharose?、右旋糖或琼脂糖）的小的非极性基团（丁基、辛基或苯基）组 成。在一些实施方案中，疏水相互作用色谱包括苯基色谱。在其他实施方案中，疏水相互作 用色谱包括丁基色谱或辛基色谱。
[0109] 在一些实施方案中，通过反相HPLC拆分片段。反相HPLC由非极性固定相和中等极 性流动相组成。在一些实施方案中，固定相是用例如RMe2SiCl处理过的二氧化硅，其中R是 直链烷基例如C1SH37或CSH17。因此对于性质上更非极性的分子而言保留时间更长，允许极性 分子更容易洗脱。保留时间通过向流动相添加极性溶剂而增加，并且通过添加更疏水的溶 剂而减少。特定RNA分子作为分析物的特征可以在其保留特征中发挥重要作用。一般而言， 具有更非极性官能团（例如，甲基）的分析物导致更长的保留时间，因为其增加了分子的疏 水性。可适用于本发明实施方案的、使用反相HPLC高度分离RNA物类的方案是本领域已 知的（参见例如，美国授权前公开 2010/0048883 ;Gilar，M./'Analysisandpurification ofsyntheticoligonucleotidesbyreversed-phasehigh-performanceliquid chromatographywithphotodiodearrayandmassspectrometrydetection"，ANAL. BI0CHEM.，298:196-206(2001))。
[0110] 本发明的特定实施方案利用本文公开的各种色谱分离的组合。例如，本发明 的特定实施方案可以利用反相离子对色谱，由此分离基于疏水性和与分子结合的阴 离子的数目，其可用于以单个HPLC步骤纯化片段。基质可以是基于二氧化硅的（例 如，Murray等人，ANAL.BI0CHEM. ,218:177-184(1994))。可以在特定实施方案中使 用非极性惰性聚合物树脂（参见例如，Huber,C.G.，"High-resolutionliquidch romatographyofoligonucleotidesonnonporousalkylatedstyrene-divinylbenzene copolymers"，ANAL.BIOCHEM.，212:351-358 (1993))。其他组合可能是等效的，并且必须就 片段尺寸和待拆分的修饰来评价。
[0111] 在一些实施方案中，可以使用HPLC系统通过强阴离子交换色谱确定加帽效率概 况和/或甲基化概况。一般而言，未加帽mRNA吸附至强阴离子交换柱的固定正电荷，使用 预定流速流动相的递增离子强度梯度以其与正电荷柱离子相互作用强度成比例地从柱洗 脱加帽物类（携带正电荷的帽）。更多负电荷（更多酸性）未加帽物类比更少负电荷（更 少酸性）加帽物类更晚洗脱。
[0112] 在某些实施方案中，通过与片段相关的甲基化概况来表征加帽片段。通常，甲基化 概况反映并定量帽鸟嘌呤碱基（N-7位置）的甲基化效率。其他实施方案还可以同时定量 倒数第二个碱基（帽1结构）核糖环2' -0位置的甲基化。在一些实施方案中，可以通过进 行单独或与离子交换色谱组合的反相HPLC来确定甲基化概况。在一些实施方案中，"甲基 化概况"指一组值，代表在向柱添加流动相之后的时间点从柱洗脱的甲基化加帽片段的量。 如上所述，性质上更非极性的甲基化帽和倒数第二个核苷酸的保留时间相对于更容易洗脱 的极性分子是增加的。保留时间可以通过向流动相添加极性溶剂而增加，并且通过添加更 疏水溶剂而减少。
[0113] 在一些实施方案中，使用高效液相色谱（"UPLC"）拆分加帽片段和未加帽片 段，并任选提供有关甲基化状态的其他定量信息。UPLC-般指使用小于2. 5ym树脂粒 径的HPLC技术，其甚至以降低的流速和线性速度提供了显著的效率增益。通过使用小颗 粒，可以拓展速度和峰容量（每单位时间拆分的峰数目）。此类技术利用色谱原理运行 分离，使用填充了更小颗粒的柱和/或更高流速以增加速度，具有更好的分离度和灵敏 度（参见例如，Swartz,M.E.,"UltraPerformanceLiquidChromatography(UPLC):an introduction"，SEPARATIONSCIENCEREDEFINED(2005))。
[0114] 在某些实施方案中，色谱分离（例如，HPLC)可以与质谱（"MS"）结合。LC-MS 方法在本领域已知用于寡核苷酸分离和鉴别，使用与MS检测相容的水性三乙基铵-六 氣异丙基醇（TEAHFIP)缓冲液（Apffel，A.等人，"Newprocedurefortheuseof HPLC-ESIMSfortheanalysisofnucleotidesandoligonucleotides^,J.CHR0MAT0GR. A，777:3-21 (1997))。可选地，三乙基碳酸氢铵流动相可用于寡核苷酸分离，柱后向洗脱剂 添加乙腈。可以选择离子配对缓冲液以产生最佳的MS检测灵敏度。
[0115]如Gilar，M.，ANAL.BiOCHEM.，298:196-206(2001)所述，还可以使用 2. 5ym全孔 C18吸收剂填充的反相HPLC柱进行加帽片段的定量分析。可以优化以增强固定相中寡核苷 酸质量转移的参数包括升高的温度、小的吸收剂粒径和缓慢流动相流速。用UV检测的三乙 基乙酸铵（TEAA)缓冲液和优化的TEA-HFIP流动相可用于加帽片段的LC-MS分离和表征。
[0116] 在一些实施方案中，通过在HPLC色谱图中各自峰面积的自动积分而实现加帽片 段及其甲基化状态的定量。数据可以表示为面积百分比值，其指特定物类积分峰面积相对 于整个色谱图总积分峰面积的百分比。
[0117] 在一些实施方案中，可以通过其他适当方法，例如基于质谱（MS)的检测来实现加 帽片段和未加帽片段的定量。认为本领域技术人员可以识别定量如本文所述加帽片段和未 加帽片段的其他可适用方法。
[0118] 试剂盒
[0119] 本发明还提供了包括用于进行根据本发明的发明方法的各种试剂和材料的试剂 盒。本文描述的定量程序可以由诊断实验室、试验实验室或商业实验室进行。本发明提供 了可用于这些不同环境的试剂盒。
[0120] 例如，用于通过酶操作和色谱分离而定量mRNA样品中mRNA加帽效率的材料和试 剂可以在一个试剂盒中组装在一起。在某些实施方案中，本发明试剂盒包括色谱柱和任选 地用于在柱上分离加帽mRNA片段的剂，以及根据本发明方法使用该试剂盒的说明书。
[0121] 每个试剂盒可以优选包括赋予程序特异性的试剂。因此，为了检测/定量mRNA加 帽效率，试剂盒可以包括在目标mRNA帽邻近特异性复性的设计序列的核酸试剂。试剂盒还 可以包括用于产生加帽片段的核酸酶；例如RNA酶H和/或S1核酸酶。试剂盒还可以包括 体外转录和加帽试剂、酶及其使用说明书。
[0122] 根据本发明的试剂盒或其他产品可以包括一个或多个容纳各种试剂的容器。适合 的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器（例如，预填充注射器）、安瓿瓶。该容器可以由多种材 料例如玻璃或塑料制成。
[0123] 在一些实施方案中，本发明试剂盒可以包括适当的对照水平或用于测定如本文所 述的对照水平的对照样品。在一些实施方案中，本发明试剂盒可以包括用于根据本发明的 一种或多种方法使用该试剂盒的说明书，并且可以包括体外转录和加帽的说明书。 实施例
[0124] 实施例1 :mRNA的合成
[0125] 通过体外转录从编码每个基因的质粒DNA模板合成萤火虫荧光素酶（FFL)和人类 促红细胞生成素（EPO)mRNA。体外转录包括通过经由鸟苷酰基转移酶的酶促辄合GTP而添 加5'帽结构帽1，其在碱基1的核糖环的2' 0H基团具有2' -0-甲基残基。通过添加与 多聚A多聚酶结合的ATP而加入长度大约200个核苷酸（如通过凝胶电泳测定的）的3' 多聚（A)尾（参见以下详细的反应条件）。体外转录产物包括5'和3'未翻译区，其在以 下序列中分别表示为X和Y:
[0126] 人类促红细胞生成素（EPO)mRNA(SEQIDN0 :1)
[0127] X3UGGGG⑶GCACGAAUGUCCUGCCUGGCU⑶GGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCC UCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAG GCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAA UUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAG CUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUG⑶CAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCC ⑶CAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGC GGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCC GGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGAYi
[0128] 密码子优化的萤火虫荧光素酶（FFL)mRNA(SEQIDNO:2)
[0129] X2AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCG GCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAG GUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUAC AAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUG UGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACC⑶C ⑶AUUC⑶GAGCAAGAAAGGG⑶GCAAAAGAUC⑶CAAC⑶GCAAAAGAAG⑶ACCGAUCAUACAAM^ CAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCA ACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACC GGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCU