UGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGG CAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGG GCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGAC UAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGA CCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCU UCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGAC GACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACU GGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUA CAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUC AUC⑶GGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAG⑶AGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCU GCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCG UCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAG AAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCG CGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCC⑶⑶AY2
[0130] Xl/Yl和X2/Y2 的 5'和 3'UTR序列如下：
[0131] Xi=
[0132] GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCU⑶UUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAG CCUCCGCGGCCGGGAACG⑶GCAUUGGAACGCGGAUUCCCC⑶GCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(SEQ IDNO：3)
[0133] X2=GGGAUCCUACC(SEQIDNO：4)
[0134] Yi=
[0135] CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC
[0136] ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(SEQIDNO:5)
[0137] Y2=UUUGAAUU(SEQIDNO：6)
[0138] mRNA的合成在完全无RNA酶的条件下进行。所有管、管形瓶、吸液管头、吸液管、缓 冲液等都要求无核酸酶。从线性化DNA模板合成信使RNA。为了生成所需的mRNA前体（IVT) 构建体，用无RNA酶的水制备~lOOug线性化DNA、rNTP(3. 33mM)、DTT(10mM)、I7RNA聚合 酶、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶和反应缓冲液（10x、800mMIfepes(pH8. 0)、20mM亚精胺、250mM MgCl2、pH7. 7)的混合物至终体积2. 24ml。反应混合物在37°C孵育20-120分钟。完成之 后，相应地用DNA酶I处理混合物另外15分钟并猝灭。
[0139] 来自前述IVT步骤的纯化的mRNA产物在65°C变性10分钟。单独地，部分 GTP(20mM)、S-腺苷基蛋氨酸、RNA酶抑制剂、2' -0-甲基转移酶和鸟苷酰基转移酶与反 应缓冲液（10x、500mMTris-HCl(pH8. 0)、60mMKC1、12. 5mMMgCl2)混合在一起至终体积 8. 3ml。变性后，冰上冷却mRNA，然后添加至反应混合物。组合的溶液在37°C孵育20-90 分钟。完成之后，添加小份ATP(20mM)、多聚A聚合酶和加尾反应缓冲液（10x、500mM Tris-HCl(pH8. 0)、2. 5MNaCl、100mMMgCl2)，将总反应混合物在 37°C进一步孵育约 20-45 分钟。完成后，最终反应混合物被相应地猝灭和纯化。
[0140]实施例2 :色谱宙量加帽效率
[0141] 本实施例说明加帽以及甲基化的色谱定量。具体地，20碱基DNA寡核苷酸被设计 并合成与体外合成的加帽mRNA的5'UTR互补，特别结合在从5'帽1或2个碱基内，并且优 选结合在邻近mRNA倒数第二个（S卩，从5'端第三个核苷酸，作为帽核苷酸的最后两个核苷 酸。DNA寡核苷酸与帽相邻5'UTR的结合确立了对RNA酶H介导的裂解敏感的DNA:RNA杂 合体的明确区域。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸任一端具有1-15个RNA核苷酸。在一 些实施方案中，DNA寡核苷酸在3'端具有1-15个RNA核苷酸。
[0142] 向包含杂交的体外合成mRNA的样品RNA溶液添加RNA酶H。RNA酶H在DNA:RNA 杂合体区域裂解体外合成的加帽mRNA，从而产生加帽片段。在某些实施方案中，使用S1核 酸酶和其他核酸酶实现该裂解以产生通过选择的帽分析物在5'端标记的平端片段。该片 段优选长度为2-10个核苷酸，包括帽核苷酸。总体上，该过程以帽存在和帽修饰的增加的 分离度提供更小的分子。
[0143] 裂解之后，将RNA溶液加载至适当的色谱柱以定量分析加帽mRNA和未加帽mRNA。 在一个示例性实施方案中，柱是阴离子交换HPLC柱，并且通过改编本领域技术人员已知 的方法纯化片段（参见例如，Wincott，F.等人，"Synthesis,deprotection，analysis andpurificationofRNAandribozymes),NUCLEICACIDSRES23:2677-2684(1995)； Anderson,A.C.等人,"HPLCpurificationofRNAforcrystallographyand NMR",RNA, 2:110-117,（1996))。通过积分对应于加帽物类和未加帽物类的色谱峰来测定样 品中加帽片段的量。数据可以峰面积或加帽峰面积与未加帽峰面积比率的形式提供。
[0144] 同时，使用相同的分析方法，评估了N-7位置鸟嘌呤帽的百分比甲基化。而且，当 合成"帽1"结构基序时，可以分离在倒数第二个碱基的核糖环的2'-0位置甲基化的物类 (图2)。可以通过许多方法实现通过HPLC对甲基化核苷酸的测量，包括并入电化学检测的 方法；参见例如，ParkandAmes(PR0C.NATL.ACAD.SCI.USA, 85:7467-7470 (1988))，其通过 引用并入本文。该方法提供了定量帽评估以及定量甲基化评估的强大组合。
[0145]实施例3:mRNA5'加帽对体内蛋白牛成的评价
[0146] 在本实施例中，我们评价了mRNA5'加帽对体内蛋白生成的影响及其对基于mRNA 疗法效力的潜在影响。具体地，我们评价了 5'加帽对a-半乳糖苷酶A(a_GalA)的体内 生成的影响，a-半乳糖苷酶A(a-GalA)在Fabry病中是缺陷的。Fabry病是X连锁的 遗传性溶酶体贮积病，特征为严重肾损伤、血管角质瘤和心血管异常，包括心室扩大和二尖 瓣闭锁不全。Fabry病还影响外周神经系统，引起四肢令人痛苦的灼痛发作。Fabry病由酶 a-半乳糖苷酶A(a-GalA)缺陷引起。a-GalA是切割各种糖辄合物的末端a-半乳糖 基部分的溶酶体羰基水解酶。Fabry病导致中性鞘糖脂、三己糖酰基鞘氨醇（CTH)的代谢阻 断以及该酶底物在细胞内和血流中的累积。
[0147] 已经分离并测序了编码人类a-GalA,GLA的cDNA和基因。人类a-GalA表达为 429-氨基酸多肽，其N端31个氨基酸是信号肽。已经在中国仓鼠卵巢（CH0)细胞（Desnick 等人，美国专利号 5, 356, 804;Ioannou等人，J.CELLBIOL. 119:1137(1992));和昆虫细胞 (Calhoun等人，TO90/11353)中表达了人类酶。
[0148] 罹患Fabry病的个体可以通过用人类a-GalA的酶替代疗法来治疗（参见例如， 美国专利号6, 458,574,通过引用并入本文）。调节或补充a-GalA缺陷表达并由此缓解 潜在缺陷的其他方法将用于开发相关疾患的适当疗法。此类方法包括能够校正现有基因缺 陷和/或给一个或多个靶细胞提供有益功能的细胞内递送核酸（例如，GLAmRNA)的方法。 在成功递送至靶组织和细胞之后，组合物和核酸转染靶细胞，并且可以将核酸（例如，GLA mRNA)翻译成关注的基因产物（例如，a-GALA)或可以其他方式调节/调整关注基因产物 的存在或表达。之前已经描述了此类方法；参见例如美国授权前公开2011/0244026,通过 引用并入本文。
[0149] 在本实施例中，我们评价了 5'加帽对体内蛋白生成的影响。通过体外转录从编码 基因的质粒DNA模板合成人类GLAmRNA，随后添加5'帽结构，帽0或帽1 (Fechter，P.等 人，J.GEN.VIROLOGY, 86 :1239-1249 (2005))。还添加了如通过凝胶电泳测定的长度大约 200个核苷酸的:V多聚（A)尾。GLAmRNA中存在的Y和:V未翻译区表示为SEQIDN0 : 7中的X和Y，如下所示：
[0150] a-半乳糖苷酶（GLA)mRNA(SEQ ID N0:7):
[0151] XAUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUC CUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGC GCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAG CUCAUG⑶CUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAG AGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACA GCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUAC UACGACAUUGAUGCCCAGAC ⑶UUG ⑶GA⑶GGGGA⑶AGAU ⑶G⑶AAAAUUUGAUG⑶腳UA⑶⑶GACM^ GGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUG AGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAU UUUG⑶GACAUUGAUGAUUC⑶GGAAAA⑶AUAAAGA⑶AU⑶UGGA⑶GGACAU⑶UUUAACCAGGAM^ UGA腳UG⑶GGACCAGGGG⑶UGGAAUGACCCAGAUA腳UA⑶GAUUGGCAA⑶UUGGC⑶CAG⑶GGM^ AAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCU CAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGACCCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCU UAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGC AGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGC UUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAA⑶CACAUAAA UCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY
[0152] X = GGGAUCCUACC (SEQ ID NO：4)
[0153] Y = UUUGAAUU(SEQ ID NO：6)
[0154] -些实施方案中还使用了具有多聚A插入物（C0-GLA-多聚A)的密码子优化的 a_半乳糖苷酶（SEQIDN0 :8):
[0155] XiAUGCAGCUGAGGAACCCAGAGCUCCAUCUCGGAUGUGCACUGGCACUUAGAUUUCUCGCGCUUGUGU CGUGGGACAUCCCCGGAGCCAGGGCGCUGGAUAAUGGGCUCGCCCGGACUCCCACAAUGGGUUGGCUGCACUGGGAG CGCUUUAUGUGCAAUCUGGACUGCCAGGAAGAGCCCGAUAGCUGUAUUUCGGAGAAGCUCUUCAUGGAAAUGGCGGA GUUGAUGGUGUCCGAAGGGUGGAAGGAUGCGGGAUAUGAGUAUCUGUGUAUCGAUGACUGCUGGAUGGCACCGCAGC GAGAUUCGGAGGGGCGAUUGCAGGCCGACCCUCAGCGCUUCCCUCAUGGAAUUCGGCAGCUGGCCAACUACGUACAC UCAAAAGGA⑶UAA⑶UGGGGAU⑶ACGCGGAC⑶CG⑶AAUAAGACAUGCG⑶GG⑶UCCCGGGGAG⑶UCG^^ ⑶AUGAUAUUGAUGCCCAGAC⑶UCGCGGA⑶GGGGA⑶GGA⑶UG⑶UAA⑶UUGAUG⑶腳UA⑶⑶GA(：UCAU UGGAAAACUUGGCGGAUGGGUAUAAACAUAUGUCCUUGGCCUUGAAUCGGACAGGGCGGUCGAUCGUCUACAGCUGC GAAUGGCCUUUGUAUAUGUGGCCGU