酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾）、0. 5g/L氯化钠、lg/L氯化铵、ImM硫酸镁、 0.ImM氯化UlOmg/L维他命Bl、5g/L酵母萃取物、20g/L葡萄糖。于光线波长550nm下测 得的细胞密度达〇. 1时，提供有限供氧条件给菌株。
[0025] 制备例2 :菌株的建构
[0026] 本实施例的菌株与引子列示于表1。
[0027] 表 1
[0028]
[0029]
[0030]用RC12171 引子（SEQIDNO:22)与RC12314 引子（SEQIDNO:28)对质体pTrc-Fdhl(Chiangetal. 2012)进行PCR以增幅出一受trc启动子（Ptrc)调控的酿酒酵 母fdhl。以BamHI限制酶处理增幅产物后，将产物连接至BamHI与Nrul等限制酶处理过的 质体pP21-Km来取得质体pP21-Fdhl。接着，用质体pP21-Fdhl将含Ptrc-fdhl的DNA片段 插入至大肠杆菌内，且移除插入至菌株内的卡纳霉素抗性基因（Chiangetal. 2008)。用 RC12154 引子（SEQIDN0:20)与RC12155 引子（SEQIDNO:21)对菌株BL21 进行PCR以增 幅出一lpdA片段，并将增幅产物插入至Ndel与Xhol等限制酶处理过的质体pMCS-5来取得 质体pMSC-lpdA。以RC12215 引子（SEQIDNO:23)与RC12216 引子（SEQIDNO:24)对质 体pMSC-lpdA中的lpdA进行E354K点突变（亦即，lpdA的蛋白质产物中第354位置由谷胺 酸变成赖胺酸）。于Ndel与Xhol等限制酶处理经点突变后的质体，取得一E354K点突变的 lpdA片段（以lpdA*表示）。然后，将lpdA*转质至夹有LE*-kan-RE*-PAPL盒匣的质体 pLoxKm_PR(Sainietal. 2014)，得到的质体pLoxKm-lpdA* 含有受LE*-kan-RE*_PAPL调 控的lpdA* (LE*-kan-RE*-PAPL-lpdA*)。另以RC12289 引子（SEQIDNO:26)与RC12290 引 子（SEQIDNO:27)增幅出lpdA的上游区域，并接合至BamHI与SacI等限制酶处理过的质 体pBluescript以得到质体pBlue-ac。以BamHI与Xhol等限制酶处理质体pLoxKm-lpdA*， 并将得到的LE*-kan-RE*_PAPL-lpdA*片段插入至质体pBlue-ac以获得质体pBlue-ac/ lpdA*。此外，以RC11210 引子（SEQIDNO:2)与RC12331 引子（SEQIDNO:29)对质体 pBlue-ac/lpdA*进行PCR。先以EcoRI切割PCR产物，后自接成质体pBlue-Ac-lpdA，其具 有受LE*-kan-RE* 阻断的lpdA。为剔除lpdA，以RC12288 引子（SEQIDNO:25)与RC12290 引子（SEQIDNO:27)对质体pBlue-Ac-lpdA进行PCR以取得一截断（truncated)的lpdA， 并电穿孔至大肠杆菌菌株内。最后，以RC10178引子（SEQIDNO:1)与RC12288引子（SEQ IDN0:25)对质体pBlue-ac/lpdA* 进行PCR来取得一含PAPL-lpdA* 的DNA片段，并 以BamHI限制酶处理此片段。透过接合此片段与经BamHI与EcoRV等限制酶处理的质体 pLam-Crt(Sainietal.2014)来取得质体pLam-LpdA*。最后，将含有PAPL-lpdA* 的DNA 片段插入至大肠杆菌内后，移除插入的标记（Chiangetal. 2012)。
[0031] 为提升内源基因的表现，将启动子PXPL置于特定基因的前方以取代原本的启动 子，详细操作于下。首先，以RC11403引子（SEQIDN0:3)与RC11404引子（SEQIDN0:4) 对菌株BL21进行PCR以增幅出一含zwf上游区域与5' -端区域的片段；以RC11407引子 (SEQIDN0 :7)与RC11408 引子（SEQIDN0 :8)对菌株BL21 进行PCR以取得一含udh上 游区域与5' -端区域的片段；以RC12085引子（SEQIDN0 :18)与RC12086引子（SEQID N0:19)对菌株BL21进行PCR以取得一含aceE上游区域与5' -端区域的片段。每一片段 经Kpnl与SacI等限制酶处理后，插入至质体pBluescript以分别取得质体pBlue-zwf、 pBlue-udhA与pBlue-aceE。之后，以RC11405 引子（SEQIDNO:5)与RC11406 引子（SEQ IDNO:6)对质体pBlue-zwf进行PCR以建立Ndel与BamHI等限制酶的切点于质体上；以 RC11409 引子（SEQIDN0:9)与RC11410 引子（SEQIDN0:10)对质体pBlue-udhA进行 PCR以建立Ndel与BamHI等限制酶的切点于质体上；以RC12058引子（SEQIDNO: 15)与 RC12059引子（SEQIDNO:16)对质体pBlue-aceE进行PCR以建立Ndel与Xbal等限制酶 的切点于质体上。以Ndel与BamHI(或Ndel与Xbal)等限制酶处理质体pLoxKm-PR以取得 LE*-kan-RE*_PAPL盒匣，并插入至质体pBlue-zwf、pBlue-udhA与pBlue-aceE来各别取 得质体pPR-zwf、pPR-udhA、pPR-aceE。最终，以RC11417 引子（SEQIDN0 :11)与RC11418 引子（SEQIDN0:12)对质体pPR-zwf进行PCR以增幅出一客座DNA(passengerDNA);以 RC11419 引子（SEQIDNO:13)与RC11420 引子（SEQIDNO:14)对质体pPR-udhA进行PCR以增幅出另一客座DNA;以RC12060 引子（SEQIDN0:17)与RC12086 引子（SEQIDN0:19) 对质体pPR-aceE进行PCR以增幅出又一客座DNA。以电穿孔法将此三客座DNA插入至菌 株，并移除标记基因（Chiangetal.2012)。
[0032]为取得pgl，用RC13292 引子（SEQIDNO:40)与RC13293 引子（SEQIDNO:41)对 菌株MG1655进行PCR。于PCR产物经EcoRV与SacI等限制酶处理后，与质体pBluescript 接合成一质体pBlue-pgl。接着，先以Smal与Xhol等限制酶处理质体pBlue-pgl，再将处 理后的产物与质体pLoxKm-PL接合。如此，可取得一含与LE*-kan-RE*-PAPL融合的pgl 的质体pSPL-pgl。然后，利用RC13001 引子（SEQIDNO:30)与RC13293 引子（SEQIDNO: 41)对质体pSPL-pgl进行PCR增幅出LE*-kan-RE*-PAPL-pgl片段。之后，将此增幅片段 接合至经EcoRI与Nrul等限制酶处理过的质体pSPL-ato(Sainietal. 2014)。同样，以 RC13034 引子（SEQIDN0:31)与RC13035 引子（SEQIDN0:32)对接合后的质体pSPL-ato 进行PCR以得到一客座DNA，并电穿孔至菌株内。最后，移除插入的标记基因。
[0033] 为调控gltA的表现，以操作子lacO取代启动子P2,取代过程如下。首先，以 RC13195 引子（SEQIDN0 :33)与RC13196 引子（SEQIDN0 :34)对质体pLoxKm-PR进 行PCR以增幅出一含操作子lacO的片段。于此片段经Smal限制酶处理后，自黏成质体 pLoxCm-LacO,此质体融合有LE*-kan-RE*-lacO。其次，以RC13197 引子（SEQIDN0 :35)与 RC13198引子（SEQIDN0:36)对菌株BL21进行PCR以增幅出一含gltA上游区域与5'-端 区域的片段。将增幅得到的片段插入至经Kpnl与Smal等限制酶处理过的质体pBluescript 来得到一质体pBlue-GltA。再者，以RC13199 引子（SEQIDNO:37)与RC13200 引子（SEQ IDNO:38)对质体pBlue-GltA进行PCR以建立Apal与Sail等限制酶的切点于质体上。 以Apal与Sail等限制酶处