理质体pLoxCm-LacO以取得LE*-kan-RE*-lac0盒匣，并接合 至建立有Apal与Sail等限制酶的切点的质体pBlue-GltA来取得一质体pBlue-GltO。最 后，以RC14025 引子（SEQIDN0 :42)与RC14026 引子（SEQIDN0 :43)对质体pKD3 进行 PCR以得到FRT-Cm-FRT盒匣。将PCR产物插入至经EcoRI与Sail等限制酶处理过的质体 pBlue-GltO,使FRT-Cm-FRT盒匣取代LE*-kan-RE* 盒匣并得到一质体pB-glt〇-Cm。同样， 以RC13197 引子（SEQIDN0 :35)与RC13201 引子（SEQIDN0 :39)对质体pB-glt〇-Cm进 行PCR以得到一客座DNA，并电穿孔至菌株内和移除插入的标记基因。
[0034] 制备例3 :分析方法
[0035]此处分析方法主要参照Sainietal, 2015。使用配有ReflectiveIndexRID-10A 的高效液相层析仪（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC;购自Shimadzu， 日本）测量葡萄糖与甘油。使用气相层析仪Trace130测量正丁醇（购自Thermo Scientific，美国）。
[0036] 胞内NADH含量为用荧光NAD+/NADH检测套组（购自CellTechnology，美国）测 得的。此项测量流程可参考使用者说明书。简言之，先对细菌培养液进行离心，并将离心得 到的细胞团回溶于200yL分解缓冲液与200yLNADH萃取液。将所得的混合液置于60°C下 约20分钟。于对混合液离心后，取出离心所得的上层物并与反应试剂混合。将得到的混合 物置于暗处、室温下1小时以进行反应。最后，以波长530至570nm的激发光与波长590至 600nm的放射光测量反应产物以取得NADH含量。
[0037] 制备例4 :酵素活性分析
[0038] 细胞培养液离心后，将离心得到的细胞团回溶于lmL溶解缓冲液。先以超音波 震荡破坏细胞，再离心。收集离心取得的上层物并称之为「无细胞萃取物（cell-free extract)」。无细胞萃取物中的总蛋白质浓度为采用Bio-Rad蛋白质分析套组测得的。丙 酮酸去氢酶的活性如Bond-Wattsetal. 2011所述于室温下用波长340nm监测NAD+的还 原，所用的反应溶液含有50mM磷酸钾（pH7. 9)、5mM丙酮酸钠、1. 3mM辅酶A、0. 5mM硫胺素 焦磷酸（thiaminepyrophosphate)、与5mM氯化镁。为开启还原反应，取lOOyL无细胞 萃取物至lmL反应溶液。葡萄糖-6-磷酸去氢酶的活性如Snoepetal. 1996所述用波长 340nm监测NADP+的还原，所用反应溶液含2mM葡萄糖-6-磷酸、0. 67mMNADP+、10mM氯化镁、 与50mMTris-氯化氢（pH7. 5)。为开启还原反应，于30°C下取100yL无细胞萃取物至lmL 反应溶液中。6-磷酸葡萄糖酸内酯酶的活性的测量如葡萄糖-6-磷酸去氢酶的活性测量 (SinhaandMaitra1992)，除了所用的反应溶液有50yM葡萄糖-6-磷酸酶、0.5mMNADP+、 50mMTris-氯化氢、10mM氯化镁、与50mMTris-氯化氢（pH7. 5)。此外，柠檬酸合成酶的活性 的测量如WalshandKoshlandJr1985所述，所使用的反应溶液含有0.ImM乙酰辅酶A、 〇? 5mM草醋酸、0? 2mM5, 5' -二硫代双（2-硝基苯甲酸）（5, 5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic Acid))、与 50mMTris-氯化氢（pH7. 5)。
[0039] 分析例1 :丙酮酸氧化途径的放大
[0040] 本实施例的起始菌株为大肠杆菌菌株BuT-8(Sainietal. 2015)，其具备了生产 正丁醇的辅酶A依赖途径，并含有丙酮丁醇梭杆菌的hbd基因、crt基因、与adhE2基因、钩 虫贪铜菌的phaA基因、及齿垢密螺旋体的ter基因。此外，为减少碳源耗损与保存NADH，自 此菌株中移除涉入不必要途径的内源基因，如adhE基因、1dhA基因、pta基因、frdA基因。 如图1所示，自一个葡萄糖还原合成成一个正丁醇需要的NADH量比醣解所提供者来的多。 依此，可期待透过补充NADH来促进正丁醇的生产。于本实施例中，连结醣解的丙酮酸节点 (node)与柠檬酸循环显然为一可行的标的。于大肠杆菌内，丙酮酸在有氧环境下透过丙酮 酸去氢酶氧化成乙酰辅酶A，而在发酵条件下透过丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate-formate lyase)氧化成乙酰辅酶A(White2007)。甲酸为丙酮酸甲酸裂解酶反应的还原产物。其 它微生物的甲酸去氢酶，如博伊丁假丝酵母（Candidaboidinii)fdh、酿酒酵母fdhl，能氧 化甲酸成二氧化碳与NADH(Berrios_Riveraetal. 2002)。此二基因早已用于大肠杆菌 内来提升胞内NADH，藉此增加正丁醇的生产（Chiangetal.2012、Shenetal.2011)。于 是，受trc启动子调控的酿酒酵母fdhl插入至菌株BuT-8内。如图2所示，所得到的菌株 BuT-8-Fdhl于有限供氧条件下生长24小时可产生3.lg/L正丁醇，且其正丁醇浓度较菌株 BuT-8的正丁醇浓度约增加25%。
[0041] 相对丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸去氢酶的反应生成了NADH作为还原产物。因此， 可期望透过控制丙酮酸去氢酶的表现来改变胞内的NADH。这可于菌株BuT-8-Fdhl中透过 P入PL启动子结合至aceEF基因操纵组达成。为使丙酮酸去氢酶对NADH的抑制不灵敏，去 除内源lpdA基因并额外建构一E354K点突变的lpdA(亦即lpdA*)于菌株BuT-8-Fdhl内， 且lpdA*受PAPL启动子控制。此时，得到的菌株称为菌株BuT-9。如图3所示，于同样条 件下，菌株BuT-9可生产4. 3g/L正丁醇。又如表2所示，菌株BuT-9中的丙酮酸去氢酶活 性约为菌株BuT-8的1. 3倍，且前者菌株中的NADH量较后者菌株多45%。
[0042]表 2
[0043]
[0044] 同样方式早已应用于具备辅酶A依赖合成途径的大肠杆菌的正丁醇生成（Shenet al. 2012、Bond-Wattetal. 2011、Limetal. 2013)。然而，习用的菌株为培养于价格昂贵 的TB培养液中；反之，本实施例的菌株为培养于相对便宜的M9Y培养液。
[0045] 分析例2 :五碳糖磷酸途径的放大
[0046] 醣解途径于葡萄糖-6-磷酸结点分支。以葡萄糖-6-磷酸为起始代谢物，五碳 糖磷酸途径产生供核酸与芳香族胺基酸合成的前驱物，并供应大量供还原性生物合成 的NADPH(White2007)。于是，可透过调节葡萄糖-6-磷酸结点来提升NADH的取得。葡 萄糖-6-磷酸去氢酶可于五碳糖磷酸途径中催化第一步，故菌株BuT-9的zwf基因融合 有PAPL启动子。于大肠杆菌内，吡啶核苷酸转氢酶的功能为NADH与NADPH的互相转变 (Canocacoetal.2001)，故菌株BuT-9的udhA基因融合有PAPL启动子。如图4所示，所 得到的菌株BuT-10可生产4. 9g/L正丁醇。如表2所示，相较于菌株BuT-9,菌株BuT-10中 的葡萄糖-6-磷酸去氢酶活性约增加2倍，且生产的正丁醇量约增加10%。
[0047] 由于菌株BuT_8衍生自大肠杆菌BL21，故其缺乏pgl基因（Meieretal. 2012)。 内酯酶主要于五碳糖磷酸途径中负责葡萄糖-6-磷酸去氢酶之后的步骤。因此，由提升表 现的葡萄糖-6-磷酸去氢酶引导至五碳糖磷酸途径中的碳流量可能会于内酯酶调控的步 骤受限。为解决此问题，自大肠杆菌K-12取得受PAPL启动子调控的pgl基因并导入至菌 株BuT-10。最后，如图5所示，所得到的菌株BuT-12可生产5. 4g/L正丁醇。如表2所示， 相较于菌株BuT-10,菌株BuT-12中的内酯酶活性约增加10倍，生成的NADH量约增加36%， 且其正丁醇量约增加25. 6%。
[0048] 由上可知，于醣解与五碳糖磷酸途径中碳流量的重新分布可影响胞内NADH的含 量。须注意的是，一个葡萄糖进入五碳糖磷酸途径会产生二个还