三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及一种三维诱导间充质干细胞转化为胰岛 细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白 质代谢紊乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。而细 胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，尤其对于已经丧失胰岛细胞功能的糖 尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的胰岛细胞或其替代物是最理想的治疗方法。目前，胰岛 细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难 极大的限制了这种疗法的应用。
[0003] 干细胞具有极强的自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想靶细胞。对 干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌胰岛素的细胞，是治疗I型糖尿病的理想策 略之一。而间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为胰岛样细胞、 软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织中，尤其是脐带、胎盘、脂肪组织 来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分化为 胰岛样细胞，为临床治疗糖尿病提供新的技术方案。
[0004] 目前将间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团多采用贴壁诱导的方式。因间充 质干细胞有较强的贴壁性，在二维诱导培养体系中阻碍了细胞聚集成团，因此诱导率普遍 较低，且诱导后获得的胰岛样细胞的细胞活性较低、活细胞比率低、胰岛细胞不够成熟等问 题。而二步法或者三步法，诱导因子使用较多，诱导周期一般为14-21天，诱导周期长、残 留因子种类繁多、细胞活性低、诱导转化率低，增加了临床应用的风险。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中间充质干细胞在二维诱导培养体 系中存在细胞活性低、诱导转化率低等缺陷，提供一种能够提高间充质干细胞的转化率和 细胞活性的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种三维诱导间充质干细胞转 化为胰岛细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007] 将间充质干细胞与PM多肽水凝胶混合后于培养基中培养，并在培养过程中添加 诱导剂进行诱导。
[0008] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述PM多肽 水凝胶是由PM多肽溶解于去离子水所获得的。
[0009] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述PM多肽 水凝胶中，PM多肽的质量分数为0. 1-0. 75%。
[0010] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述PM多肽 水凝胶与间充质干细胞混合前，还包括采用基础培养液或完全培养液浸润所述PM多肽水 凝胶的步骤。
[0011] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述PM多肽 水凝胶与间充质干细胞混合前，还包括采用完全培养液重悬间充质干细胞的步骤，并使得 间充质干细胞的浓度为1x104个/mL-1X10 6个/mL。
[0012] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述培养基为 含有EGF、bFGF、银杏提取液和FCS的IMDM培养液或DMEM培养液。
[0013] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述培养基 中，EGF的浓度为10-20ng/ml、bFGF的浓度为10-20ng/ml、银杏提取液的浓度为10-20ng/ ml和FCS的质量分数为2-10%。
[0014] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述诱导剂包 括尼克酰胺和HGF。
[0015] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述尼克酰胺 的浓度为 10-20ng/ml，HGF的浓度为 10-20ng/ml。
[0016] 在本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，培养过程中添 加所述诱导剂进行诱导步骤中，诱导时间为4-7天。
[0017] 实施本发明提供的三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，可以达到以下 有益效果：利用具有三维网状结构的凝胶肽为间充质干细胞提供一个模拟人体内细胞生长 的环境，为间充质干细胞提供充足的生长空间和营养需求，有利于间充质干细胞的扩增及 提高间充质干细胞的细胞活性。
【具体实施方式】
[0018] 为解决现有技术中间充质干细胞在二维培养体系中，间充质干细胞扩增效果不 佳，活性不高等缺陷，本发明的创新点在于提供一种三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细 胞的方法，通过在培养基中加入具有三维网状结构的PM多肽水凝胶，能够模拟人体内细胞 生长环境，为间充质干细胞提供充足的生长空间和营养需求，从而实现了提高间充质干细 胞活性及扩增倍数的目的。
[0019] 本发明提供的一种三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，包括以下步 骤：获取间充质干细胞，将间充质干细胞与PM多肽水凝胶混合后用诱导剂进行诱导培养。
[0020]PM多肽水凝胶具有三维网状结构，能够模拟人体内细胞生长的微环境，增大了间 充质干细胞与培养基和氧气的接触面积，有利于细胞之间信号的传导，同时，由于间充质干 细胞为较强的贴壁细胞，PM多肽水凝胶的三维网状结构，也为间充质干细胞提供更充足的 附着生长空间，更有利于间充质干细胞的扩增，同时，PM多肽水凝胶保水性较强，也可提高 间充质干细胞的活性。
[0021]优选地，本发明所采用的PM多肽水凝胶（又称PuraMatrix凝胶肽），购自于BD公 司，PuraMatrix多肽是由16个氨基酸残基组成的一种肽，没有包含明显的生长因子或细 胞因子，自组装形成纳米纤维结构，溶于水溶液中，疏水和离子氨基酸结合形成三维网状结 构的凝胶状，即PM多肽水凝胶，可以为间充质干细胞提供充足的生长空间，扩大间充质干 细胞与培养液的接触面积，有利于间充质干细胞的扩增。目前，PM多肽水凝胶公开的用途 为用于组织再生，如骨填充物，伤口愈合以及用于药物输送系统等，而本发明中将PM多肽 水凝胶溶于水之后，利用其三维网状结构进行间充质干细胞的诱导培养，能够获得较好的 间充质干细胞的培养效果。
[0022] 具体地，间充质干细胞在三维培养体系中的过程为：
[0023] 1、用去离子水溶解PM多肽，获得PM多肽水凝胶；
[0024] 2、浸润步骤1获得的PM多肽水凝胶；
[0025] 3、获取间充质干细胞，并与步骤2中获得的PM多肽水凝胶混合；
[0026]4、将步骤3中与PM多肽水凝胶混合后的间充质干细胞于培养基中培养，并在培养 过程中添加诱导剂进行诱导培养。
[0027] 步骤1中，由于PM多肽溶于水中，疏水和离子氨基酸结合形成三维网状结构， 而电解质物质会影响PM多肽在水中的溶解度，因此，在该步骤中采用去除电解质物质的 去离子水进行溶解稀释PM多肽原液，优选地，PM多肽水凝胶中，PM多肽的质量分数为 0. 1% -0. 75%，PM多肽水凝胶浓度过大，则PM多肽水凝胶形成的网状结构过于致密，不利 于细胞因子的传递和细胞之间信号的转导，或导致细胞的缺氧，不利于细胞的增殖培养。
[0028] 步骤2中，可采用基础培养液或完全培养液对步骤1中的PM多肽水凝胶进行2-4 次浸润，以使培养液中的细胞因子和营养因子部分融入到PM多肽水凝胶中，以增加PM多肽 水凝胶表面的细胞亲和性，有利于细胞贴附，并使基础培养基中的细胞因子和营养因子部 分融入到PM多肽水凝胶中，维持细胞生长。
[0029] 步骤3中，由于P3间充质干细胞增殖较旺盛，细胞活性较强，本发明中优先选取P3 代间充质干细胞，用完全培养液重悬细胞浓度为1X104-1X106个/ml，将细胞悬液加入步 骤2中的PM多肽水凝胶溶液中，静置，待细胞与PM多肽水凝胶充分均匀混合。
[0030] 步骤4中，所采用的培养基为DMEM培养液或頂DM培养液，其中含有10-20ng/mL 的EGF(表皮生长因子），10-20ng/mL的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子），10-20ug/mL银 杏提取液及2-10 %FCS(胎小牛血清），持续诱导4-7天后，再加入含有5-20ng/mL尼克酰 胺/和5-20ng/mL的HGF的诱导剂，再持续诱导4-7天，每两天换液1次，直至间充质干细 胞转化为胰岛细胞。可以理解的是，该步骤中所采用的诱导剂也并不局限于此，现有技术中 可将间充质干细胞转化为胰岛细胞的诱导培养液均使用本发明。
[0031] 其中，EGF能够促进间充质干细胞的增殖，以及胰岛细胞团的形成。bFGF不仅能促 进间充质干细胞的增殖以及细胞体积的增大，还有助于间充质干细胞转化成胰岛细胞。银 杏提取液是根据国际标准提取工艺提取的，其中含有丰富的抗氧化酶、黄酮类及银杏内酯 等，能够中和掉细胞培养过程中积累的氧自由基，这样可以使得细胞分裂到很高的密度而 不死亡，从而有利于间充质干细胞的增殖，降低细胞的氧化作用，提高细胞内谷胱甘肽的 水平，清除氧自由基，防止细胞在诱导或扩增的过程中过早的凋亡，有利于间充质干细胞的 转化；还会影响动物细胞胆固醇的代谢。FCS含有丰富的细胞生长必须的营养成份，提供对 维持细胞指数生长的激素，是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需因子来源，并提供蛋白酶抑 制剂，使在细胞传代时剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，同时，起酸碱度缓冲液作用。
[0032] 而尼克酰胺的主要作用是参与呼吸链，参与细胞增殖转化的呼吸过程及电子传递 过程，促进细胞的增殖转化，尼克酰胺是组成NAD+和NADP+的一个部分，组成的NAD+和 NADP+通过电子传递链，传递H+，合成ATP;同时尼克酰胺能够调节细胞内的ATP/ADP的比 例，从而引起细胞膜上ATP敏感性钾通道的关闭，膜发生去极化，继而导致电压依赖性钙通 道开放，钙离子内流，触发了胰岛0细胞分