霉素溶液也可以替换为终浓度45IU/ml 的卡那霉素溶液，效果相同。
[0021] 二、培养液的使用 本发明培养液配制完成后应在4个小时内使用，剩余液体应放置于2~8°C储存。
[0022] 培养液使用前，用1%的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8~7. 25。
[0023] 将原代细胞分散后，按照2~4X104个/cm2细胞浓度接种至3L转瓶，加入适量上 述配制的细胞培养液振荡均匀后，置于36. 5~37. 4°C温度下进行培养，直至细胞长成合格单 层， 24小时细胞即可贴壁60~80% ; 72小时可长成基本单层，细胞密度达1. 2~1. 5X105个/cm2; 120小时可长成致密单层，细胞密度达1. 8~2. 5X105个/cm2; 细胞形态饱满，活力旺盛，死细胞数量较少，无拉长、圆缩等不良病变。
[0024] 本发明配制的培养液支持原代地鼠肾细胞多次培养，能明显减缓细胞衰减，5代以 内仍能保持良好增殖速率，96小时细胞增殖保持4~6倍以上。
[0025] 将传统市售可用于培养原代细胞的MEM和DMEM培养基(液）和本申请配制的培养 液进行对比，原代细胞生长情况见下表：
从上表中可以看出，细胞消化分散后24小时贴壁情况，以及72小时和120小时的细胞 生长密度对比，本申请配制的培养液具有明显的优势。
[0026] 实施例2 一、培养液的配制 按照实施例1的方法配制5倍浓缩的Hanks'平衡盐溶液； 第二步，配制营养液 按照实施例1的方法配制5倍浓缩的营养液； 第三步，配制培养液 无菌操作分别将第一步配制的Hanks'平衡盐溶液20L，第二步配制的营养液20L，浓度 7. 5%的新生牛血清7. 5L和终浓度20IU/ml的硫酸庆大霉素溶液0. 6L打入配液罐中，补加 无菌注射用水定容至100L。物料全部转移完毕后，保持转速30~50r/min搅拌20~30分钟， 使之混合均匀，即可得到金黄地鼠肾原代细胞培养液。
[0027] 实际配制时，终浓度20IU/ml的硫酸庆大霉素溶液也可以替换为终浓度40IU/ml 的卡那霉素溶液，效果相同。
[0028] 实施例3 一、培养液的配制 按照实施例1的方法配制20倍浓缩的Hanks'平衡盐溶液； 第二步，配制营养液 按照实施例1的方法配制15倍浓缩的营养液； 第三步，配制培养液 无菌操作分别将第一步配制的Hanks'平衡盐溶液5L，第二步配制的营养液6. 7L，浓度 12%的新生牛血清12L和终浓度30IU/ml的硫酸庆大霉素溶液0. 6L打入配液罐中，补加无 菌注射用水定容至100L。物料全部转移完毕后，保持转速30~50r/min搅拌20~30分钟，使 之混合均匀，即可得到金黄地鼠肾原代细胞培养液。
[0029] 实际配制时，终浓度30IU/ml的硫酸庆大霉素溶液也可以替换为终浓度50IU/ml 的卡那霉素溶液，效果相同。
[0030] 将本申请实施例1和本申请实施例2、实施例3配制的培养液进行对比，原代细胞 生长情况见下表：
从上表中可以看出，细胞消化分散后24小时贴壁情况，以及72小时和120小时的细胞 生长密度对比，本申请实施例1配制的培养液比实施例2、实施例3具有一定的优势，但与市 售的MEM和DMEM培养基相比，本申请实施例1、2、3配制的培养液均具有明显的优势。
【主权项】
1. 一种金黄地鼠肾原代细胞培养液，其特征在于：所述培养液的组分包括Hanks'平衡 盐溶液、水解乳蛋白、L-谷氨酰胺、L-盐酸半胱氨酸、新生牛血清、硫酸庆大霉素/卡那霉 素；其配制过程如下： 第一步，配制Hanks'平衡盐溶液 取Hanks'平衡盐，加注射用水，充分溶解后得到Hanks'平衡盐溶液备用； 第二步，配制营养液 按比例称量水解乳蛋白90份，L-谷氨酰胺4份，L-盐酸半胱氨酸1. 9份，用注射用水 将其充分溶解后得到营养液备用； 第三步，配制培养液 将第一步配制的Hanks'平衡盐溶液和第二步配制的营养液按比例分别在无菌状态下 过滤到配液罐中，然后将新生牛血清75~120份和硫酸庆大霉素溶液/卡那霉素溶液6份分 别过滤至配液罐中，添加注射用水定容，搅拌均匀后即可得到金黄地鼠肾原代细胞培养液。2. 根据权利要求1所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，其特征在于：所用注射用水的 温度为31~37°C。3. 根据权利要求1所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，其特征在于：所述第一步中配 制的Hanks'平衡盐溶液为5~20倍浓缩液；所述第二步中配制的营养液为5~15倍浓缩液。4. 根据权利要求3所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，其特征在于：所述Hanks'平衡 盐溶液为10倍浓缩液；所述营养液为10倍浓缩液。5. 根据权利要求1所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，其特征在于：第三步中所述的 新生牛血清的浓度为7. 5-12%。6. 根据权利要求5所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，其特征在于：所述新生牛血清 的浓度为8. 5%。7. 根据权利要求1所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，其特征在于：第三步中如果添 加硫酸庆大霉素溶液，则其终浓度为20~30 IU/ml ;如果添加卡那霉素溶液，则其终浓度为 40-50 IU/ml〇8. 根据权利要求7所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，其特征在于：所述硫酸庆大霉 素溶液的终浓度为24 IU/ml;所述卡那霉素溶液的终浓度为45 IU/ml。
【专利摘要】本发明公开了一种金黄地鼠肾原代细胞培养液，其组分包括Hanks’平衡盐溶液、水解乳蛋白、L-谷氨酰胺、L-盐酸半胱氨酸、新生牛血清、硫酸庆大霉素；首先取Hanks’平衡盐加注射用水，溶解得到Hanks’平衡盐溶液；按比例准确称量水解乳蛋白，L-谷氨酰胺，L-盐酸半胱氨酸，加注射用水溶解后得到浓缩的营养液备用；将Hanks’平衡盐溶液和营养液分别无菌过滤到配液罐中，然后加入新生牛血清和硫酸庆大霉素溶液，加注射用水定容，搅拌后即可得到金黄地鼠肾原代细胞培养液。本发明配制方法简单，配制的成品培养液能更好的促进金黄地鼠肾原代细胞的生长，细胞贴壁时间快，形态好，细胞增殖迅速，活力旺盛。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105062955
【申请号】CN201510510230
【发明人】戚凤春, 杨宪普, 贾雷, 张涛, 王红霞, 张志红, 陈巧燕
【申请人】河南远大生物制药有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月19日