相对应的L3/L4位点。
[0084] 第一次转换，本发明中采用中间载体R1/R2位点间的负筛选标记（PheS)与含靶 向元件载体的L1/L2位点间的双报告（Venus-Luc)系统元件（SA-T2A-H2B_venus-T2A-LU C-pA-promoter-puro-pA) (Sanger研究所）发生置换（图6)，第二次转化体系通过R3-L3 和R4-L4反应，将含有同源臂和靶向元件的片段转移到一个含有哺乳动物负筛选标记基因 (DTA)的高拷贝的质粒（Sanger研究所）中，R3和R4位点位于靶向载体同源臂的末端，L3 和L4位点之间包含哺乳动物负筛选标记基因。最终通过R3/R4与L3/L4位点反应产生高 拷贝的目的载体，命名为Idl-Venus-Luc-MCl-DTA的重组载体。（图7)。
[0085] 实施例三：人胚胎干细胞Idl基因打靶双报告基因Idl-Venus-Luc细胞株的构建
[0086] 在用AsiSI线性化处理后，将Idl-Venus-Luc-MCl-DTA的质粒电转P57代人胚 胎干细胞-种经过传代的人胚胎干细胞，可以从市场上购买得到）。在37°C，C025% 的条件下，通过含血清替代物的培养基在DR4MEF-滋养层细胞-(美国应用干细胞有限公 司）上，每天换液培养。使用BioRad电转仪（ZAP:250V，uF500,TC8. 6)电转，然后用用 puromycin筛选共得到19个克隆，挑选出发绿色焚光整合型质粒克隆（带MC1-DTA质粒型 的细胞不能存活），检测荧光素活性与内源性Id基因表达的一致性（图8)。
[0087] 我们发现克隆2在同量BMP4刺激下，可观察到荧光素酶表达水平与QPCR测得 IdlmRNA转录水平一致，并且在刺激后1，2, 3, 5小时测得的酶活性随时间增长而加大，可以 通过荧光素酶表达水平最大限度地反映外界刺激对Id基因表达的影响。所以选定克隆2 定名为ID1-V-LUChES并进行对化合物的复筛（图9)。ID1-V-LUChES进行早期中胚层 分化，获得表达平滑肌细胞标志aSMA，Calponin的血管细胞类型。ID1-V-LUChES分化细 胞株在BMP4 (Peprotech公司）刺激下，可观察到浓度梯度激活效应，6. 25ng/mLBMP4刺激 ID1-V-LUC4小时后调解率达到7. 5倍。31个化合物在两个不同浓度（2yg/mL，10yg/mL) 4 小时刺激后比较活性水平（图10)。说明Venus-Luci双报告基因驱动Idl启动子系统人胚 胎干细胞株ID1-V-LUChES模型可应用于高通量药物筛选。ID1-V-LUChES模型干细胞株 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCCNo:11091
[0088] 实施例四：Venus-Luci双报告基因驱动Idl启动子系统人胚胎干细胞株模型的应 用
[0089] 将ID1-V-LUChES模型干细胞接种于96孔板，待细胞集落长满全孔的80 % 左右时，移去原有培养基，用PBS轻轻漂洗一次，加入人胚胎干细胞mTeSR培养基（杭 州百通生物技术公司）饥饿6h后，将1H_吡唑[3, 4-d]嘧啶，1_苯_4_(1-哌啶 基）-(CasNo:23000-46-6)，2-乙酰苯并噻吩（CasNo:22720-75-8)，芒柄花黄素（Cas No:485-72-3)。用上述培养基逐级稀释成5, 2. 5, 1. 25, 0. 625, 0. 3yg/mL，顺次加入接种有 模型干细胞的96孔板中，每个浓度平行做三个复孔，同时以只含有0. 1%。DMS0的培养基作 为空白对照。37°C，5%C02条件下培养18~24h后，用CCLR(Promega)细胞裂解液裂解细 胞，按LuciferaseAssaySystem报告基因检测系统说明书所述方法检测焚光素酶表达活 性。
[0090] 按如下公式计算化合物在各个浓度下的荧光素酶表达活性调节率：
[0091]
[0092] 结果表明，哌啶基-嘌呤类衍生物以剂量依赖的方式上调模型干细胞荧光素酶的 表达水平，其中2. 5yg/mL的上调水平最高，达到3. 31倍左右（图11)。表明该化合物可以 上调Id基因表达。
[0093] 实施例五：哌啶基-嘌呤类衍生物对野百合碱肺动脉高压（MCT-PAH)造模大鼠的 治疗效果
[0094]MCT-PAH大鼠体内实验：雄性Sprague-Dawley大鼠（中国食品药品检定研究院） 单次皮下给予野百合碱（MCT，55mg/kg)或生理盐水，MCT注射1周后灌胃给予4. 5mg/kg哌 啶基-嘌呤类衍生物（PP)，2-乙酰苯并噻吩化合物（2AZ)，20或50mg/kg芒柄花黄素（Form) 和生理盐水及阳性药对照西地那非（Sildenafil)。给药4周后，统计存活率（图12)，表明 哌啶基-嘌呤类衍生物和2-乙酰苯并噻吩化合物，芒柄花黄素对肺动脉高压（MCT-PAH)造 模大鼠有良好的治疗效果。
【主权项】
1. 一种保藏编号为CGMCCl 1091的细胞株。2. -种筛选抗肺动脉高压的化合物的模型，所述模型特征在于， 以BMP信号下游关键基因Idl基因为靶点，设计双报告基因原件插入Idl基因组构建 重组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的CGMCC11091的细胞株，将待测抗肺动 脉高压的化合物刺激CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所 述方法检测荧光素酶表达活性，以Idl启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对 Idl表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型。3. 构建权利要求2所述模型的方法，其特征在于，步骤如下： (1) 从数据库中找到Idl基因的基因组序列，确定打靶位点为其外显子1，检索包含Idl 基因完整序列的BAC质粒（5'和3'上下游5Kb序列）； (2) 生物信息学分析：利用AOS电脑程序，设计并选择最优的位于Idl基因1号外显子 ATG下游23Ibp的U5和D3位点，用于重组打靶； (3) PCR反应产生基因特异性重组片段： 用于扩增重组片段的引物是由通用引物序列和Idl基因序列共同组成，电转将抗性筛 选框插入已诱导重组酶活性的BAC质粒中，获得带筛选框的BAC-Idl质粒； (4) 中间载体的构建： 将一个基于PsclOl质粒框架、四环素（Tet)诱导重组的质粒PsclOlgbaA，转化至携带 含Idl基因BAC质粒（BAC-Idl)的E. Coli克隆中；通过第一次同源重组将带有gateway R1/R2位点和细菌正（zeocin)负（pheS)筛选标记的DNA片段插入到BAC-Idl质粒U5/D3 位点中；第二次同源重组将带有R3和R4两个gateway位点的pBR322质粒片断与BAC-Idl 进行gap-repair反应，获得中间载体； (5) 目的重组载体的构建： 目的载体的构建基于Gateway系统的三个质粒：本发明构建的中间载体和含有祀向元 件的pLlL2_BacT质粒以及含负筛选标记的pL3L4_DTA质粒组成。经两次gateway的转换 体系，最终产生高拷贝的目的重组载体Idl-Venus-Luc-MCl-DTA ; (6) 筛选细胞株的获得 将Idl-Venus-Luc-MCl-DTA质粒用AsiSI线性化处理，电转P57代人胚胎干细胞H9,获 得整合型Idl启动子驱动Venus-Luci双报告基因表达的人胚胎干细胞株，得到CGMCC11091 的细胞株，进行早期中胚层分化，将待测抗肺动脉高压的化合物和CGMCC11091的细胞株接 触，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Idl启 动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Idl表达上调的治疗肺动脉高压化合物的 筛选模型。4. 用权利要求2所述模型筛选后得到的化合物在制备抗肺动脉高压的药物中的应用， 所述化合物选自： IH-吡唑[3, 4-d]嘧啶，1-苯-4-(1-哌啶基）-(Cas No: 23000-46-6)， 2-乙酰苯并噻吩（Cas No :22720-75-8)， 芒柄花黄素（Cas No:485-72-3)。5. 根据权利要求4所述的应用，所述的应用还包括对以下药物的筛选： (1)上调骨形态形成蛋白（BMP)信号的调节剂； (2) 上调骨形态形成蛋白II型受体表达水平的调节剂； (3) 改善肺动脉血流动力学的制剂； (4) 改善肺血管重构的制剂； (5) 肺动脉高压治疗药物； (6) 心肺血管疾病治疗药物。
【专利摘要】本发明属于应用干细胞技术建立肺动脉高压新型治疗药物筛选的技术，以BMP信号下游关键基因Id1基因为靶点，设计双报告基因原件插入Id1基因组构建重组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的CGMCC11091的细胞株，将待测抗肺动脉高压的化合物刺激CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Id1启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型，本发明还包括模型在上调骨形态形成蛋白(BMP)信号的调节剂；上调骨形态形成蛋白II型受体表达水平的调节剂；改善肺动脉血流动力学的制剂；改善肺血管重构的制剂；肺动脉高压治疗药物以及心肺血管疾病治疗药物筛选中的应用。CGMCC 1109120150723
【IPC分类】C12N15/85, C12Q1/66, C12Q1/68, C12N5/10, C12Q1/02
【公开号】CN105062976
【申请号】CN201510475276
【发明人】杨隽, 周芳, 宫世强, 韦清霞, 赵双, 司书毅
【申请人】中国医学科学院基础医学研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月5日