ENTRll-Pubi: :mEPSPS-TgluB5,采用碱裂解 法大量提取质粒DNA，纯化后直接用于植物遗传转化或用限制酶Kpnl消化纯化的质粒，琼 脂糖凝胶电泳分离回收"KpnI-Pubi ::mEPSPS-TgluB5-KpnI"片段，用于直接导入法或基因 枪轰击法为基础的植物遗传转化。
[0050] 玉米自交系胚性愈伤组织遗传转化
[0051] 自交系郑58植株在自交授粉后9-12天，取果穗剥去苞叶后于70 %酒精中浸泡 5min，无菌条件下挑取约1. 0-1. 2mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松 脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养基每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈 伤组织作为遗传转化的受体材料。
[0052] 采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取l.Oym大小的金粉，经70%乙醇洗涤后 静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50%灭菌甘油（终浓度为 60mg/ml微弹）贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5 y 1质粒片段（目 标）0嫩(11^/^1)、5(^112.511〇&(：12、2(^10.邡亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋 涡2~3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70%乙醇静置。然后离心弃上清液，再用 无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0. 5mg。
[0053] 在直径9cm的培养皿中倒入0. 4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养 皿中，每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2. 5cm，载体与阻挡网的距离 为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培 养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。将 材料转入加有草甘膦（0.1 %浓度）的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继 代时淘汰变褐死亡的组织块。经过筛选的抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照 16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根 培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约l〇cm高时栽到大田中，自交或与郑58植株回交结 实。
[0054] 转基因植株的分子检测和选择
[0055] 耐除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片微量提取DNA，采用PCR技术检测耐草甘膦 基因mEPSPS或TgluB5片段。
[0056] 转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4-6 叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因，并统计外源基因在子代植株 中的分离比例。对PCR阳性植株进行Southern blotting检测以确定转基因植株。转基因 植株后代长至三叶期，喷洒添加0. 1 % Tween-20和0. 2%的草甘膦溶液（有效成分41 %的 农达），每盆5mL，盆子大小为21. 5cmX 16cm，均勾喷洒至植株叶片布满水珠。喷洒7天后未 转基因自交系（对照）小苗明显受害，出现枯萎坏死，15天后死亡率在90-95%。经除草剂 筛选后，将耐性植株移栽到大田。
[0057] 由于基因枪轰击法产生的转基因植株，转基因多以多拷贝存在，为了获得转基因 单拷贝的株系，在完成Southern blotting检测后，对单拷贝转基因植株连续自交以获得转 基因纯合系，对多拷贝转基因植株则与郑58连续回交2-3代，并对回交后代进行草甘膦耐 性检测，然后自交1-2代获得转基因纯合系。对转基因纯合系采用RT-PCR技术确定转基 因表达水平，从中挑选出形态特征和生长发育与郑58差异不明显的耐草甘膦的株系进行 Southern blotting检测，确定转基因的拷贝数。选择单拷贝或低拷贝转基因的株系用于后 续工作。
[0058] 转基因植株草甘膦耐性的检测和应用
[0059] 基本工作同昌7-2的转基因耐草甘膦材料的选择及应用。在玉米小苗生长至6-8 叶期进行草甘膦耐受剂量测定。配制的草甘膦除草剂水溶液分别为0.2% (1L水含有2mL 农达和11111^￥661120)、0.4%、0.6%、1.0%浓度，喷洒量为11311117111 2，即喷洒剂量相当于田 间推荐用量（〇. 84kg a. e. ha-1)的1倍、2倍、3倍和5倍。低浓度草甘膦溶液喷洒后，随时 间推移，药害程度不断加深，非转基因玉米表现出叶色变深发褐、叶尖及下部叶片变黄，植 株逐渐萎蔫、茎杆松软倒伏、停滞生长，最终枯死，少量存活植株也表现出生长停滞和畸形。 转基因玉米植株则正常生长，一般受害症状不明显，少数虽出现药害，但逐渐消失。喷洒高 浓度草甘膦溶液草甘膦溶液，非转基因玉米一周内全部死亡，部分转基因株系无明显药害， 继续生长。第12天观察统计，在72个检测的株系中有2个转基因株系对草甘膦表现出很 好的抗性，可耐受5倍推荐剂量的草甘膦溶液。
[0060] 为了评估喷洒除草剂草甘膦对转基因耐草甘膦玉米植株生长发育和产量的影响， 繁殖转基因株系种子，在大田进行草甘膦喷洒试验。实验区分为草甘膦使用区和对照区 (不喷洒草甘膦），转基因玉米各株系和其受体自交系（未转基因对照）按小区种植，随机 排列各基因型。小区长3米宽2米，种3行，株距0.26米，行距0.6米。精心种植，保证苗 全。在对照区，设4次重复，按常规耕作措施管理，观察转基因玉米植株在形态特征和生长 发育速率上与未转基因对照植株是否有明显差别，测定各小区株高、穗位高和籽粒产量。在 草甘膦使用区，设12个重复区，7叶期植株分别喷洒推荐剂量（0. 84kg a. e. ha-1)、2倍推荐 剂量、3倍推荐剂量和5倍推荐剂量的草甘膦溶液，其它耕作措施同对照区。即每剂量每基 因型重复3次。观察植株形态特征和生长发育速率与未喷洒草甘膦植株的差异，测定株高、 穗位高和籽粒产量。未转基因对照植株在喷洒推荐剂量草甘膦12天后逐渐死亡，而转基因 植株因耐性不同出现差异，耐性优异的株系在喷洒3倍推荐剂量草甘膦后仍叶片翠绿，无 受害症状，10天后测定株高，只比对照区植株低2-5厘米；喷洒3周测定株高，草甘膦使用 区和对照区的转基因玉米的株高基本相同。成熟后测定产量，草甘膦使用区的转基因玉米 比对照区的略高，可能与田间杂草减少有关。当用5倍推荐剂量的草甘膦溶液喷洒时，只有 2个转基因入选株系的植株不表现出明显药害，即未出现叶片受损和植株明显变矮。在喷洒 10天后测定株高，对照区植株低2-7厘米；喷洒3周测定株高，草甘膦使用区和对照区的转 基因玉米相比株高低1-5厘米。成熟后测定产量，草甘膦使用区的转基因玉米与对照区的 相近。
[0061] 选出耐草甘膦特性优异的转基因株系进行配合力测定，选择配合力与供体自交系 相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。
【主权项】
1. 一种抗除草剂草甘膦基因表达结构，其特征在于：所述基因表达结构由玉米 Ubiqitinl基因启动子-人工合成的草甘膦耐性基因mEPSPS-水稻GluB5基因终止区 TgluB5核苷酸片段构成；其中，所述草甘膦耐性基因mEPSPS的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，所述水稻GluB5基因终止区TgluB5核苷酸片段的序列如SEQ ID No. 3所示，所述玉 米Ubiqitinl基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。2. 权利要求1所述抗除草剂草甘膦基因表达结构在培育耐除草剂草甘膦作物中的应 用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述作物是玉米自交系或杂交种。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述玉米自交系是玉米自交系昌7-2或郑 58 〇
【专利摘要】本发明公开一种抗除草剂草甘膦基因表达结构，是由玉米Ubiqitin1基因启动子-人工合成的草甘膦抗性基因mEPSPS-水稻GluB5基因终止区TgluB5核苷酸片段构成。实验证实，将所述抗除草剂草甘膦基因表达结构以正义形式重组到植物表达载体中，通过转基因技术导入玉米可实现其高效表达，该技术可广泛应用于耐除草剂草甘膦玉米的培育，具有很好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/54, A01H5/00
【公开号】CN105063070
【申请号】CN201510552397
【发明人】李朝霞, 靳传娣, 徐绍栋
【申请人】山东连发农业科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月1日