盐的过程会放出热量，为保持反应顺 利进行，低温是最合适的。
[0036] 优选地，所述步骤还包括步骤D的反应结束后，离心分离反应液，取上清液透析， 离心分离，得纯化后的邻苯二甲酸二乙酯人工免疫原DEP-BSA。
[0037] 本发明还提供了一种邻苯二甲酸二乙酯的人工免疫原DEP-BSA的用途，用于痕量 塑化剂邻苯二甲酸二乙酯的检测。
[0038] 人工免疫原的表征：
[0039] 将制备的人工免疫原适当稀释，使其吸光度在0. 1~2之间，以PBS为空白对照， 用紫外分光光度计在200~500nm分别测定DEP半抗原和DEP-BSA吸光值，绘制紫外吸收 光谱图，并根据以下公式计算偶联比：
[0040]
[0041 ]式中：〇DCC]_gate 偶联物吸光度；ODprotein 蛋白质吸光值；ODhapten 半 抗原吸光值；Chapten--半抗原浓度；Cprotein--蛋白质浓度；Mhapten--半抗原分子量； Mpr〇tein--蛋白质分子量。
[0042] 本发明的邻苯二甲酸二乙酯人工免疫原DEP-BSA的应用，通过免疫动物制备抗邻 苯二甲酸二乙酯特异性抗体，能与邻苯二甲酸二乙酯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白IgG反应，用于水体、土壤、大气等环境样品和各类食品中痕量塑化剂邻苯二甲酸二乙酯的 检测。
[0043] 由于邻苯二甲酸二乙酯是小分子物质，只具有反应原性而没有免疫原性，而且该 分子上没有能与蛋白质分子直接结合的氨基、仲氨基等官能团，故本发明通过选择4-硝基 邻苯二甲酸为原料，经两步反应制备带有氨基活性基团的DEP半抗原，然后用重氮化法将 这个含氨基的半抗原与蛋白质分子偶联制备人工免疫原，在将制备的免疫原对新西兰大白 兔免疫，得到高特异性的抗邻苯二甲酸二乙酯多克隆抗体，此抗体将用于建立针对邻苯二 甲酸二乙酯的亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析方法。
[0044] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0045] (1)抗原实用性强：邻苯二甲酸二乙酯抗原制备和抗体制备具有重要的实用价值 和现实意义。利用本专利中的方法，成功制备了邻苯二甲酸二乙酯人工免疫原DEP-BSA。本 发明的制备方法中各条件明确细化，再制备成功率提高，制备效果理想。该人工免疫原保留 了邻苯二甲酸二乙酯的结构，具有针对邻苯二甲酸二乙酯的抗原决定簇，为制备特异性好、 效价高的抗体和建立亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析方法提供了保障。
[0046] (2)抗原稳定性好：此法合成的邻苯二甲酸二乙酯人工抗原具有较好的稳定性， 在0~4°C环境下可保存1年不变性，_20°C环境下可保存3年。
[0047] (3)抗原制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需特别的仪器设备，成本低 廉，容易工业化规模生产。
[0048] (4)与现有技术制备的DEP免疫原相比，该免疫原偶联比更高，更适合用于免疫动 物制备多克隆抗体，且制备的多克隆抗体效价高，为建立免疫分析方法奠定更好的基础；且 基于此技术建立的检测方法是目前批量检测DEP最为高效、快速的方法。
【附图说明】
[0049] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0050] 图1为邻苯二甲酸二乙酯半抗原红外光谱；
[0051] 图2为邻苯二甲酸二乙酯半抗原的核磁共振谱图；
[0052] 图3为邻苯二甲酸二乙酯半抗原、载体蛋白BSA和人工免疫原DEP-BSA紫外吸收 光谱图；
[0053] 图4为免疫新西兰大白兔产生的抗DEP抗体效价的变化；
[0054] 图5为间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测邻苯二甲酸二乙酯的标准工作曲线。
【具体实施方式】
[0055] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0056]实施例1邻苯二甲酸二乙醅半抗原的制备与鉴宙
[0057] (1)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备
[0058] 取洁净的容积为IOOmL三口圆底烧瓶，向瓶底装入IOg(0. 0474mol) 4-硝基 邻苯二甲酸，随后缓慢加入16. 6mL(0. 2850mol)无水乙醇，边搅拌边加入I. 65mL浓 H2S04(0 . 0 3 04mol)催化，86°C搅拌回流，直至薄板层析法（TLC)检测原料点消失为止（显色 剂：丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾；展开剂，正己烷：乙酸乙酯=5:1);搅拌回流9h后反 应完成；蒸馏除去未反应的乙醇和生成的水；此时将液体趁热倒入冰水中，析出固体；过滤 后得到的固体粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层无色（pH7. 0-8. 0);最后，油状粗品用无水 乙醇重结晶纯化，-20°C冻干后得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯即DEP半抗原 中间体。
[0059]将I. 5g(0. 0056mol)DEP半抗原中间体（4-硝基邻苯二甲酸二乙酯）装入容积为 500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入280mL(3. 1495mol)苯，待半抗原被苯 溶解后再加入3. 4g纯锌粉（0? 0520mol)，搅拌均匀后分次加入IOmL浓HCl(0? 1200mol)， 室温搅拌15min后再次加入3. 4g纯锌粉（0. 0520mol)，35°C搅拌反应IOh;反应结束后，将 340mL冷水加入反应体系，并用IM氢氧化钠溶液中和至弱碱性（pH7. 0-8. 5);静置Ih后分 离出苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，水洗后用无水Na2SOJ^水干燥，萃取液减压蒸馏 以除去苯，得到的浅黄色固体再用无水乙醇重结晶，硅胶柱层析（洗脱剂为，乙酸和正己烷 的混合液（V/V= 8:l))后减压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二乙酯，即DEP半 抗原。邻苯二甲酸二乙酯半抗原分子式=C12H15NO4;分子量237. 25 ;产率76. 2%;熔点：90~ 92°C，纯度 98%。
[0060] (2)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的鉴定
[0061] 将制得的半抗原经红外光谱（图1)、核磁共振光谱（图2)鉴定，红外光谱结果 为：IR(KBr)V/cm1Z3466. 06, 3369. 16 (-NH2)，1720. 18(C= 0)，1257. 81，1068. 87 (C-O-C)， 2980. 89, 2927. 48 (-CH3)，1449. 97 (d-0CH2-)，1630. 07, 1564. 19, 1449. 97(C=C)， 3227. 98, 1604. 33, 833. 75 (C-H,Ar) 〇 核磁共振结果为=1HNMR(400MHz,CDC13): 8 7. 73 (d, 1H,ArH) , 6. 73 (d, 1H,ArH), 6. 67 (d, 1H,ArH), 4. 36 (q, 2H,OCH2), 4. 30 (q, 2H, OCH2)，4. 26(b, 2H, -NH2)，I. 39(t, 3H,OCH2)，I. 33(t, 3H, 0CH2)ppm。红外、核磁表征结果表明， DEP半抗原具有-NH2、-O-CH2CH3、苯环等基团的特征吸收峰，证明制备的DEP半抗原分子中 含有氨基官能团，最终实验中成功制备了DEP半抗原。
[0062] 从以上分析可知，所合成的产物为目标物。
[0063]实施例2、邻苯二甲酸二乙醅半抗原的制备与鉴宙
[0064] (1)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备
[0065] 取洁净的容积为IOOmL三口圆底烧瓶，向瓶底装入IOg(0. 0474mol) 4-硝基 邻苯二甲酸，随后缓慢加入13. 7mL(0. 2370mol)无水乙醇，边搅拌边加入I. 55mL浓 H2S04(0 . 0 2 8 5mol)催化，90°C搅拌回流，直至薄板层析法（TLC)检测原料点消失为止（显色 剂：丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾；展开剂，正己烷：乙酸乙酯=5:1);搅拌回流8h后反 应完成；蒸馏除去未反应的乙醇和生成的水；此时将液体趁热倒入冰水中，析出固体；过滤 后得到的固体粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层无色（pH7. 0-8. 0)。最后，油状粗品用无 水乙醇重结晶纯化，-20°C冻干后得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯即DEP半抗 原中间体。
[0066] 将I. 5g(0. 0056mol)DEP半抗原中间体（4-硝基邻苯二甲酸二乙酯）装入容积为 500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入288mL(3. 2480mol)苯，待半抗原被苯 溶解后再加入3. 3g纯锌粉（0. 0504mol)，搅拌均匀后分次加入IOmL浓HCl(0. 1232mol)， 室温搅拌15min后再次加入3. 3g纯锌粉（0. 0504mol)，30°C搅拌反应Ilh;反应结束后，将 330mL冷水加入反应体系，并用IM氢氧化钾溶液中和至弱碱性（pH7. 0-8. 5);静置Ih后分 离出苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，水洗后用无水Na2SOJ^水干燥，萃取液减压蒸馏 以除去苯，得到的浅黄色固体再用无水乙醇重结晶，硅胶柱层析（洗脱剂为，乙酸和正己烷 的混合液（V/V= 8:l))后减压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二乙酯，即DEP半 抗原。邻苯二甲酸二乙酯半抗原分子式=C12H15NO4;分子量237. 25 ;产率76. 2%;熔点：90~ 92°C，纯度 98%。
[0067] (2)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的鉴定
[0068] 将制得的半抗原经红外光谱、核磁共振光谱鉴定，红外光谱结果为：IR(KBr) V/cmh3466. 06, 3369. 16 (-NH2)，1720. 18(C= 0)，1257. 81，1068. 87 (C