高产率制备生理活性多肽复合物的改进方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制造生理活性多肽、非肽聚合物连接子及免疫球蛋白恒定区通过 共价键连接而成的复合物的方法。更具体地，本发明涉及一种在制造生理活性多肽复合物 时，将盐用于偶联反应，以此改善低产率问题而可高效地制造生理活性多肽复合物的方法。
【背景技术】
[0002] 通常，生理活性多肽因其稳定性低而易于变性，且被血液中的蛋白水解酶分解而 易于通过肾脏或肝脏排除，因此为了保持包含生理活性多肽作为药物成分的蛋白质药物在 血液中的浓度与效价，需要频繁地向患者投用蛋白质药物。然而，在以注射剂形态向患者投 用的大部分蛋白质药物的情况下，频繁地进行注射以保持生理活性多肽在血液中的浓度， 而这会给患者带来非常大的痛苦，且产生高昂的治疗费用。为了解决这种问题，不断进行努 力以增加蛋白质药物在血液中的稳定性且长时间较高地保持血液中的药物浓度而将药效 极大化。这种蛋白质药物的长效制剂需要在增加蛋白质药物的稳定性的同时，使药物本身 的效价保持在足够高的水平，且应避免在患者体内引起免疫反应。
[0003] 作为稳定蛋白质、抑制与蛋白水解酶的接触及由肾脏造成损失的方法，以往采用 了向蛋白质药物表面化学加成像聚乙二醇（polyethylene glycol :以下简称为"PEG"）一 样溶解度较高的高分子的方法。已知PEG非特异性地结合到靶蛋白的特定位点或多个位点 而增加溶解度，由此在稳定蛋白质且防止蛋白质水解的方面有效，并且也不会导致任何特 殊的副作用（Sada 等，J. Fermentation Bioengineering 71:137-139,1991)。
[0004] 然而，使用PEG的方法虽可增加PEG分子量而延长肽药物在生物体内的药效时间， 但存在如下问题：分子量越增加则肽药物的效价越明显降低，并且与肽的反应性越降低而 产率减少。
[0005] 另外，制造免疫球蛋白片段与生理活性多肽的融合蛋白的方法虽可克服聚乙二 醇化（pegylation)产率低的问题及非特异性，但存在如下问题：血液半衰期的增加效果 不如预期明显，在一些情况下效价较低。为了将血液半衰期的增加效果极大化而还使用 多种肽连接子，但存在可能引起免疫反应的可能性。另外，在使用像BNP -样具有二硫键 (disulfide bond)的肽的情况下，存在如下问题：错误折叠（misfolding)的概率较高而难 以应用；及在具有非天然氨基酸残基的情况下，无法以基因重组的形态生产。
[0006] 胰岛素作为从人的胰腺的0细胞分泌的肽，是一种对调节体内的血糖发挥重要 作用的物质。在无法正常地分泌这种胰岛素或所分泌的胰岛素在体内无法正常地发挥作用 的情况下，无法调节体内的血糖而导致血糖升高，将这种状态称为糖尿病。将之前所提及的 情况称为II型糖尿病，将无法从胰腺分泌胰岛素而导致血糖升高的情况称为I型糖尿病。 在II型糖尿病的情况下，利用以化学物质为主要成分的口服降血糖剂进行治疗，对于一部 分患者，还利用胰岛素进行治疗。相反地，在I型糖尿病的情况下，必须投用胰岛素。
[0007] 目前比较常用的胰岛素治疗法是在餐前或餐后注射胰岛素的方法。然而，这种胰 岛素治疗法需要持续地每天注射3次胰岛素，因此给患者带来极大的痛苦与不适。为了克 服这种问题而进行了各种尝试，其中之一就是提高肽药物对生物膜的透过度而通过口腔或 鼻腔吸入肽药物至体内。然而，这种方法与注射剂相比，肽的体内传递效率明显较低，因此 按照所要求的条件保持肽药物在体内的活性仍较为困难。
[0008] 另外，具有在皮下投用过量的药物后延缓吸收的方法，通过这种方法，每天 投用一次来保持在血液中的浓度。其中一部分已获批为医药产品（例如，Lantus、 Sanofi-aventis)而目前正投用给患者。另外，进行了以脂肪酸修饰胰岛素而加强胰岛素聚 合物的结合，并与投用部位及血液中的白蛋白结合而延长药效时间的研究，其中一部分已 获批为医药产品（例如，Levemir、NovoNordisk)。然而，这种方法具有在投用部位引起疼痛 的副作用，而且每天一次的注射投用间隔对患者而言仍为较大的负担。
[0009] 为了解决这种问题，本发明人等作为增加胰岛素等生理活性多肽的血液半衰期的 同时，可将在生物体内保持活性的时间极大化的方法，制造了将非肽聚合物用作连接子而 包含生理活性多肽及免疫球蛋白恒定区的复合物。然而，构成这种复合物的原料价格昂贵， 因此仍迫切需要以高产率及高纯度制造所述复合物的方法。在这种背景下，本发明人等确 认到如下情况而以至完成了本发明：在制造复合物时的偶联阶段，在反应溶液中使用适当 的种类及浓度的盐时，能够以高产率及高纯度制造生理活性多肽复合物，因此可减少制造 成本。
【发明内容】
[0010] [发明要解决的问题]
[0011] 本发明的目的在于提供一种在制造生理活性多肽、非肽聚合物连接子及免疫球蛋 白恒定区通过共价键连接而成的复合物时，可改善制造产率较低的问题的高效的制造方 法。
[0012] [解决问题的手段]
[0013] 作为达成所述目的的一个实施方式，本发明提供一种生理活性多肽-非肽聚合 物-免疫球蛋白恒定区复合物的制造方法，其包含如下步骤：（1)使非肽聚合物与生理活性 多肽或免疫球蛋白恒定区中的任一个进行反应的步骤；及（2)在存在盐的条件下，使所述 步骤（1)的反应混合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区中的任一个进行反应的步骤。
[0014] 优选地，所述非肽聚合物可在两个末端分别独立地具有选自由醛衍生物、马来酰 亚胺衍生物及琥珀酰亚胺衍生物所构成的群组中的反应基。
[0015] 更优选地，非肽聚合物可通过所述两个末端的反应基，分别通过共价键而与生理 活性多肽及免疫球蛋白恒定区连接。
[0016] 优选地，在所述步骤（1)后，还可包含从反应混合物中分离生理活性多肽-非肽聚 合物结合体或免疫球蛋白恒定区-非肽聚合物结合体的步骤。
[0017] 优选地，所述盐可选自由氯化钠（sodium chloride)、乙酸钠（sodium acetate)、 硫酸钠（sodium sulfate)、磷酸钠（sodium phosphate)、碳酸钠（sodium carbonate)、氛 化钠（sodium cyanide)、朽1 檬酸钠（sodium citrate)、硝酸钠（sodium nitrate)、氯化 钾（potassium chloride)、乙酉爱钾（potassium acetate)、硫酉爱钾（potassium sulfate)、 磷酉爱钾（potassium phosphate)、碳酉爱钾(potassium carbonate)、氛化钾(potassium cyanide)、朽1 檬酸钾（potassium citrate)、硝酸钾（potassium nitrate)、氯化儀 (magnesium chloride)、乙酉爱儀（magnesium acetate)、硫酉爱儀（magnesium sulfate)、磷酉爱儀（magnesium phosphate)、碳酉爱儀（magnesium carbonate)、氛化儀（magnesium cyanide)、朽1 檬酸儀（magnesium citrate)、硝酸儀（magnesium nitrate)、氯化铵 (ammonium chloride)、乙酉爱铵（ammonium acetate)、硫酉爱铵（ammonium sulfate)、磷酉爱铵 (ammonium phosphate)、碳酉爱铵（ammonium carbonate)、氛化铵（ammonium cyanide)、梓檬 酉爱铵（ammonium citrate)、硝酉爱铵（ammonium nitrate)、氯化 f丐（calcium chloride)、乙 酸?丐（calcium acetate)、硫酸?丐（calcium sulfate)、磷酸?丐（calcium phosphate)、碳酸 ?丐（calcium carbonate)、氛化?丐（calcium cyanide)、梓檬酸?丐（calcium citrate)或硝 酸?丐（calcium nitrate)所构成的群组。
[0018] 更优选地，所述盐可选自由氯化钠、乙酸钠、硫酸钠、磷酸钠及氯化钾所构成的群 组。
[0019] 优选地，所述盐可按照0. 1至3. 0M的最终浓度添加。
[0020] 更优选地，所述盐可按照0. 3至2. 5M的最终浓度添加。
[0021] 优选地，在所述盐为氯化钠的情况下，可按照低于3. 0M的最终浓度添加，在为乙 酸钠的情况下，可按照低于2. 5M的最终浓度添加，在为硫酸钠的情况下，可按照低于0. 7M 的最终浓度添加，在为磷酸钠的情况下，可按照低于〇. 8M的最终浓度添加，或在为氯化钾 的情况下，可按照1. 0M以下的最终浓度添加。
[0022] 优选地，所述步骤（2)的反应时间可为4至18小时。
[0023] 优选地，所述步骤（2)的反应温度可为0至25°C。
[0024] 优选地，在所述非肽聚合物具有一个以上的醛衍生物作为反应基的情况下，可在 反应混合物中以1至100mM的最终浓度加添还原剂。
[0025] 优选地，所述步骤⑴可在pH值为5. 0至6. 5的条件下进行，步骤⑵可在pH值 为6.0至8. 5的条件下进行。
[0026] 优选地，在所述步骤（1)中，可使非肽聚合物与生理活性多肽进行反应，在步骤 (2)中，可使步骤（1)的反应混合物与免疫球蛋白恒定区进行反应。
[0027] 优选地，所述步骤（1)可使生理活性多肽与非肽聚合物按照1 : 1至1 : 20的摩 尔比进行反应，步骤（2)可使步骤（1)的生成物与免疫球蛋白恒定区按照1 : 0.5至1 : 10 的摩尔比进行反应。
[0028] 更优选地，所述步骤（2)在盐为氯化钠的情况下，可按照低于3. 0M的最终浓度添 加而进行，在盐为乙酸钠的情况下，可按照低于2. 5M的最终浓度添加而进行，在盐为硫酸 钠的情况下，可按照低于〇. 7M的最终浓度添加而进行，在盐为磷酸钠的情况下，可按照低 于0. 8M的最终浓度添加而碱性，或在盐为氯化钾的情况下，可按照1. 0M以下的最终浓度添 加而进行。
[0029] 优选地，所述非肽聚合物的反应基可分别键结到生理活性多肽及免疫球蛋白恒定 区的N-末端胺基或Lys残基侧链的胺基。
[0030] 优选地，所述非肽聚合物可选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚 物、聚乙氧化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、PLA(聚乳酸，polylactic acid)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸，polylactic-glycolic acid)、脂质聚合物、壳多糖、透明质 酸及它们的组合所构成的群组。
[0031] 更优选地，所述非肽聚合物可为聚乙二醇。
[0032] 优选地，所述非肽聚合物的分子量范围可为1至lOOkDa。
[0033] 优选地，所述免疫球蛋白恒定区可被非糖基化。
[0034] 优选地，所述免疫球蛋白恒定区可由选自由CH1、CH2、CH3及CH4区所构成的群组 中的1个至4个区构成。
[0035] 优选地，所述免疫球蛋白恒定区可进一步包含铰链区。
[0036] 优选地，免疫球蛋白恒定区可选自由IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、它们的组合 (combination)及通过它们的混合（hybrid)而成的恒定区所构成的群组。
[0037]优选地，所述免疫球蛋白恒定区可选自由IgG 1、IgG2、IgG3、IgG4、它们的组合及它 们的混合物的恒定区所构成的群组。
[0038] 更优选地，所述免疫球蛋白恒定区可为IgG4Fc区。
[0039] 进而优选地，所述免疫球蛋白恒定区可为非糖基化人IgG4Fc区。
[0040] 优选地，所述生理活性多肽可选自由人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释 放肽、干扰素、干扰素受体、集落刺激因子、类胰高血糖素肽（GLP-1等）、胃泌酸调节素、G蛋 白偶联受体（Gprotein-coupled receptor)、白细胞介素、白细胞介素受体、酶类、白细胞介 素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、 蛋白质A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑 制因子、转化生长因子、a-1抗胰蛋白酶、白蛋白、a-乳白蛋白、载脂蛋白E、促红