治疗剂等的组 合治疗，且与至少一种治疗剂等的组合治疗可以带来协同作用的结果。
[0092] 本发明包括在生物样品（例如，血液、血清、细胞、组织）或来自患有补体-相关的 疾病的对象或患有其风险的对象中确定C5蛋白质和/或核酸的表达以及C5蛋白质功能的 诊断测定。在本发明的抗体中，例如，放射性免疫测定（REA)、酶联免疫吸附测定（ELISA) 和径向扩散测定可用于检测补体裂解产物。此外，可以将诊断测定、预后测定、药理学基因 (pharmacological genetic)和临床监测用于预防性治疗目的为预后（预测）的对象。另 外，本发明提供预后（预测）测定用于确定对象是否处于与补体途径的异常激活调节相关 的疾病发作的风险中。例如，C5基因的突变可以在生物样品中测定。通过使用目的为预后 或预测的该测定，在特征为C5蛋白质、核酸的表达或活性的疾病或随其相关的疾病发作之 前可以预防性治疗对象。
[0093] 另外，本发明提供用于诊断补体_相关的疾病的试剂盒，其包括：C5-结合分子；和 容器。用于本发明诊断的试剂盒可以至少包括任何一种上述C5-结合分子。容器可以包括 固体载体，C5-结合分子可以结合到固体载体，固体载体可以为多孔或非多孔的，扁平的或 非平面的。
[0094] 此外，本发明提供C5-结合分子在制备用于治疗补体-相关的疾病的药剂中的用 途。用于制备药剂或包含它们的组合物的本发明的C5-结合分子可以与可接受的载体等混 合，且可以以与其它试剂一起的复方药物制备以具有活性成分的协同作用。
[0095]另外，本发明提供C5-结合分子的用途。用于治疗本发明的补体-相关的疾病的 C5-结合分子可以以治疗目的使用，以及可以以用于确定来自患有补体-相关的疾病的对 象或处于其风险的对象的C5蛋白质和/或核酸的表达或C5蛋白质功能的预后测定的用途 使用。
[0096] 除非相互矛盾，否则本发明的用途、组合物和治疗方法的描述以彼此相同的方式 应用。
[0097] 本发明的C5-结合分子对诊断、预防和治疗补体-相关的疾病有效。
【附图说明】
[0098] 图1显示根据本发明的示例性实施方式使用兔（A)和鸡⑶的免疫库在生物淘选 之后随机选择的40个克隆的吸光度。
[0099] 图2显示根据本发明的示例性实施方式选自兔的免疫库和鸡的免疫库的五种抗 体以及依库珠单抗（其为人C5的比较性抗体）的吸光度测量结果。
[0100] 图3显示由五个突变的亚库获得的对C5具有结合亲和力的许多克隆的结果。
[0101] 图4显示通过使用HRA-06克隆产生的具有改善的亲和力的克隆的结合亲和力的 比较性结果，所述HRA-06克隆为根据本发明的示例性实施方式作为模板的人源化克隆。
[0102] 图5显示根据本发明的示例性实施方式产生的抗体在补体依赖性细胞毒性测定 中具有高的补体依赖性细胞毒性抑制能力。
[0103] 图6显示根据本发明的示例性实施方式产生的抗体在C5a生成测定中具有高的 C5a生成抑制能力。
[0104] 图7显示根据本发明的示例性实施方式产生的单克隆抗体的物种交叉反应性。
[0105] 图8显示根据本发明的示例性实施方式通过尺寸排阻色谱法产生且纯化的抗体 的结果。
[0106] 图9显示根据本发明的示例性实施方式抗体结合到C5的0链。
[0107] 图10显示根据本发明的示例性实施方式抗体结合到C5的0链的MG4结构域。
[0108] 图11显示根据本发明的示例性实施方式抗体特异性结合到突变的Fc融合蛋白中 的MG4结构域，在Fc融合蛋白中从0链的C端依序去除一个结构域。
[0109] 图12显示根据本发明的示例性实施方式的抗体结合到突变体中0链的N-末端 处第332个至第348个氨基酸残基，MG4结构域从所述突变体中依序去除，如通过免疫印迹 确认。
[0110] 图13显示根据本发明的示例性实施方式的抗体结合到0链的N-末端处的第379 个至第398个氨基酸残基，如通过ELISA确认。
[0111] 图14显示根据本发明的示例性实施方式的抗体结合到0链的N-末端处第386 个至第392个氨基酸残基（基于MG4结构域序列为第55个至第61个氨基酸序列），如通过 ELISA确认。
【具体实施方式】
[0112] 在下文中，通过以下实施例更详细地描述本发明的组分和技术特征。然而，以下实 施例通过实施例的方式提供，且因此，本发明的保护范围并不限于仅以下实施例。
[0113] 参考附图描述本文所述的各种实施例。在以下描述中，描述各种具体细节，例如， 特定形式、组合物和制备方法等以完全理解本发明。然而，在不含至少一种具体细节或连同 其它已知的方法和形式的情况下，可以实践具体实施例。在另一示例性实施方式中，未以具 体细节描述已知方法和制造技术以免不必要地混淆本发明。在整个说明书中提及的"一个 示例性实施方式"或"实施例"意指描述的与实施例相关的具体特征、形式、组合物或性质被 包括在本发明的一个或多个实施例中。因此，在整个说明书的不同地方中表达"一个示例性 实施方式"或"实施例"的情况不一定指明本发明的相同示例性实施方式。另外，通过在至少 一个示例性实施方式中的任何合适的方法可以将具体特征、形式、组合物或性质彼此组合。
[0114] 实施例1. C5免疫抗体库的构建
[0115] 将 5 y G 的人 C5 蛋白质（Calbiochem)与 RIBI MPL+TDM+CWS 佐剂（51811^，5七 Louis，Mo, USA)混合，皮下注入NZW兔和鸡，并在2周间隔内对兔进行三次加强免疫，对鸡进 行四次加强免疫。通过使用TRI试剂（In Vitr〇gen，CarlSbad，CA，USA)从免疫完成的兔的 脾脏和骨髓以及免疫完成的鸡的脾脏、骨髓和法氏囊分离总RNA，并使用oligo-dT引物和 Superscript? III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)合成第一链 cDNA〇 通 过使用下文表9(兔）和表10(鸡）的引物构建单链Fv库，所述引物对免疫球蛋白的重链 可变区和轻链可变区为特异的。对于兔scFv库，将\的10个引物组合（9X V 1和IX V A) 和％的4个组合用于扩增编码序列。对于鸡scFv库，将每fV ；^PVH的一个引物组合用于 扩增编码序列。
[0116] 表 9.兔单链 Fv 库的 VK、VjPVj^_
[0117]
[0118]
[0119]
[0120] 表10.鸡单链Fv库的VjP VH的引物
[0121]
[0122]
[0123] 在每个反应中，将lyl cDNA与60 pmol各个引物、10yl 10X反应缓冲液、 8yl 2. 5 mM dNTP、0. 5yl Taq DNA聚合酶和水混合至100yl的最终体积。在以下 条件进行PCR反应：在94 °C保持15sec (秒），在56 °C保持30sec，以及在72 °C保持 90sec;30个循环；随后在72°C进行lOmin(分钟）的最终延伸。将长度大约为350个 碱基对的扩增片段上样，在1.5 %的琼脂糖凝胶上跑样，并用QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN，Valencia, CA，USA)纯化。在第二轮PCR中，将第一轮\产物和VH产物通过重 叠延伸PCR随机连接。在由lOOng纯化的\产物和VH产物、60pmol各个引物、10yl 10X 反应缓冲液、8 y 1 2. 5mM dNTP和0. 5 y 1 Taq DNA聚合酶组成的100 y r混合物中进行每个 PCR反应。在以下条件进行PCR反应：在94°C保持15sec，在56°C保持30sec以及在72°C 保持2min;20个循环；随后在72°C进行lOmin的最终延伸。用QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN)纯化约700个碱基对大小的scFv片段。通过在50°C温育8小时，将scFv片段 和 pComb3XSS载体用 Sfil 限制性内切酶（Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA) 消化。通过将反应混合物在16°C温育12小时使用T4DNA连接酶将700ng Sfil-消化的 scFv与1400ng pComb3X载体连接，随后乙醇沉淀。将连接的库通过电穿孔转化入大肠杆菌 ER2738。将细胞用3ml超级肉汤（SB)培养基重新悬浮并在37°C温育1小时同时在250rpm 下振荡。然后，将l〇ml SB培养基和3yl 100mg/ml羧苄青霉素加入至培养基。通过将 0. 1 y 1、1 y 1和10 y 1培养物铺板在含有50 y g/ml羧苄青霉素的Luria Broth(LB)平板 上确定库大小。在温育一小时之后，将4. 5yl 100mg/ml的羧苄青霉素加入至培养物并再 温育一小时。将培养物加入至2ml VCSM13辅助噬菌体（>10ncfu/ml)、183ml SB培养基和 92. 5 y 1 100mg/ml的羧苄青霉素中并在37°C温育2小时同时在250rpm下振荡。将卡那霉 素（280 y 1)加入至培养物中，并将培养物在250rpm和37°C下振荡过夜。第二天，将培养物 在3000g离心15min。将细菌沉淀保存用于噬菌粒DNA制备，并将上清液转移至干净的离心 瓶中。加入8g聚乙二醇-8000 (PEG-8000, Sigma)和6g NaCl (Merck)，并将上清液在冰上储 存30min。在4°C下将上清液在15,000g离心15min。将噬菌体沉淀重新悬浮在含有1%牛 血清白蛋白（BSA)Tris-缓冲盐水（TBS)中。
[0124] 实施例2:生物淘选
[0125] 在室温下将3ug的人C5抗体用1X107个磁珠（Dynabeads M270-Epoxy，Invitrogen)包覆16小时。用PBS洗涤珠粒并在室温下用含有3 % BSA的 PBS封闭1小时。将包覆的珠粒洗涤并在室温下与噬菌体-展示的scFv -起温育2小时。 将珠粒用〇. 5%的TPBS洗涤以去除未结合的噬菌体。将结合的噬菌体用100ul0. 1M甘氨 酸-HC1洗脱并用6ul 2M Tris-HCl(pH 9.0)中和。将洗脱的噬菌体感染大肠杆菌ER2738 并用VCSM13辅助噬菌体救援过夜扩增。通过在37°C将噬菌体感染的细菌培养物铺在含有 50 y g/ml羧苄青霉素的LB平板上确定投入和产出噬菌体滴度。第二天，通过加入如在实施 例1中所述的PEG-8000和NaCl沉淀噬菌体。
[0126] 实施例3.通过噬菌体ELISA选择scFv克隆
[0127] 针对人C5进行使用菌体展示scFvs的ELISA以从生物淘选中分析选择的克隆。 在4°C将微量滴定96孔板用100ng的人C5/孔涂覆过夜并用含3% BSA的PBS封闭。将每 个噬菌体培养物与等体积的含6% BSA的PBS混合，加入至人C5-涂覆的96-孔板中，并在 37°C温育2小时。在完成温育之后，将板洗涤并用HRP偶联的抗-M13抗体（Amersham，USA) 温育。在完成温育之后，洗涤板并将含lμg/ml 2, 2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺 酸）（ABTS，Amresco, 0H，USA)的0. 05M柠檬酸缓冲液和1. 0% H202加入至每孔中，随后形成 颜色，并在405nm处测量吸光度。
[0128] 图1中显示其结果。
[0129] 图1A显示兔的免疫库，图1B显示鸡的免疫库。如对人C5显示出吸光度为0. 6或 更多的克隆的基因序列的分析结果，从来自兔免疫库的两种克隆以及来自鸡免疫