含两性离子的吖啶*化合物的制作方法
【专利说明】含两性离子的吖啶错化合物
[0001] 本申请是2010年11月12日申请的发明名称为"含两性离子的吖啶错化合物"、 国家申请号为201080052010. X的发明专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及含有两性离子的亲水、化学发光n丫陡働化合物（acridinium compounds)。由于其亲水性质，这些吖啶働化合物显示出与固相的低非特异性结合，并且对 于改善测定灵敏度潜在有用。
[0003] 发明背景
[0004] 化学发光卩丫陡铸t酯（acridinium esters)已显现为用于免疫测定以及核酸测 定的非常有用的标记。来自吖啶II酯的光发射通过与碱性过氧化氢反应触发，这引起酚 酯键的分裂和其为光发射种类的激发态吖啶酮的形成。在苯酚离去基团离开后二噁酮 (dioxetanone)中间产物的形成已在反应机制中提出，并且假定是激发态吖啶酮的前体。取 决于反应条件，来自吖啶隹翁酯的光发射的持续时间通常在数秒内完成，并且可以使用光度 计进行定量测量。吖啶織酯9-羧基苯基-N-甲基吖啶鐵溴化物在免疫测定中的应用由 Simpson，J. S. A.等人（Nature第279卷，第646-647页（1979)公开。然而，这种卩丫陡.鐵酯 是非常不稳定的，从而限制其商业效用。这种不稳定性起于在苯酚和吖啶鐵.环之间的不稳 定9-羧基苯基酯连接的水解。
[0005] 在稳定R丫陡鐵酯中的酸酯的尝试中，Law等人（Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence,第4卷，第88-89页（1989)引入2个侧接甲基，以稳定这个酯键。发 现所得到的立体稳定的吖啶隹貧酯，缩写为DMAE-NHS [2 '，6 ' -二甲基-4' - (N-琥珀酰亚胺氧 羰基）苯基10-甲基吖啶锚-9-羧酸盐]，具有与缺乏2个甲基的吖啶備酯相同的光输出。 另一方面，当与免疫球蛋白缀合时，前面一种化合物的稳定性是极佳的，并且甚至在37°C在 pH 7下1周后也未显示化学发光活性的丧失。相比之下，当实施相同处理时，未被取代的吖 啶鶴I酯仅保留其10%的活性。
[0006] 为了减轻DMAE及其衍生物的疏水性质，Law等人的美国专利号5, 656, 426公开 了命名为NSP-DMAE-NHS酯的亲水形式的DMAE，其中N-甲基已由N-磺丙基（NSP)替换。 DMAE和NSP-DMAE目前在Siemens Healthcare Diagnostics的商业、自动化免疫测定分析 仪ACS : 180?和Centaur ?中广泛使用。
[0007] 为了进一步增加NSP-DMAE的亲水性，Natrajan等人在美国专利号6, 664, 043B2 中公开了具有与苯酚连接的亲水改性剂例如聚乙二醇和阴离子精胺衍生物的NSP-DMAE衍 生物。称为NSP-DMAE-HEG-戊二酸酯-NHS(缩写为NSP-DMAE-HEG)且含有六乙二醇衍生物 (HEG)的一种此类吖啶輸酯的结构在下述附图中举例说明。在这种化合物中，a，《-二 氨基六乙二醇（二氨基-HEG)部分连接至苯酚，以增加吖啶鐵酯的水可溶性。戊二酸酯 部分连接至二氨基-HEG的末端并且转化为NHS酯，以使得能够标记各种分子。除HEG外， 衍生自具有磺酸根和羧酸根基团的精胺的阴离子改性剂也由Natrajan等人在美国专利号 6, 664, 043 B2 中公开。
[0008] 近来，Natrajan等人在美国专利号7, 309, 615 B2中描述了在吖啶儀|环的C2和/ 或C7上含有亲水烷氧基（0R*)的亲水、高量子产率吖啶鐵化合物，其中R*是包含磺丙基部 分或乙二醇部分或其组合的基团。来自此类化合物增强的光输出及其亲水性质使得其对于 改善免疫测定的灵敏度有用。称为NSP-2,7-(0MHEG) 2-DMAE-AC-NHS(缩写为HQYAE)的一 种此类化合物的结构在下文举例说明。在美国专利号7, 309, 615 B2中描述的这种化合物 及其他化合物含有代替苯酚连接至吖啶铸t环的聚乙二醇或阴离子磺酸根基团
[0009]
[0010] 如上述专利中公开的在吖啶鐵酯的结构中掺入聚乙二醇（PEG)部分和阴离子意 欲增加这些吖啶镦酯的亲水性质以及降低衍生自这些化合物的缀合物的非特异性结合。在 使用固相例如颗粒或微量滴定板的测定中的非特异性结合是这些吖啶鐵酯缀合物与这些 固相的不需要的结合相互作用。这些不需要的结合相互作用一般增加测定的背景，导致在 测定中信噪比的净降低且从而减少测定灵敏度。
[0011] 衍生抵抗蛋白质吸收的惰性表面的聚乙二醇用途已在现有技术中描述。例如， Ostuni等在J. Am. Chem. Soc. 2000,17, 5605-5620中评估了连接至自装配单层用于抵抗蛋 白质吸收的众多官能团，并且观察到赋予最佳抗性的聚乙二醇官能团。更近来，Ladd等人 在Biomacromolecules 2008,9,1357-1361中；及其他人已报道两性离子改良的亲水表面 与PEG -样对于蛋白质吸收是惰性的，并且此外，已假定两性离子比PEG在化学上更稳定， 这是由于后者对于氧化切割的倾向。某些常见两性离子例如磺基甜菜碱、羧基甜菜碱、磷基 甜菜碱（phosphobetaines)和氧化胺的结构在下述附图中举例说明。如同PEG,这些两性离 子通常是电学中性的，由于在给定结构内正和负电荷的平衡（R1-R4 -般是烷基）。
[0012] 两性离子的例子
[0013]
[0014] 其中氮原子是季氮的磺基甜菜碱在广泛pH范围内维持其电学中性。另一方面，具 有三取代的氮的磺基甜菜碱在更高pH (pH >7)下可以获得负电荷，因为它们可以在氮上去 质子化，从而中和其正电荷。类似地，羧基甜菜碱在更高pH下是电学中性的但可以在羧酸 根基团上质子化，并且在低pH (pH < 5)下获得净正电荷。
[0015] 用于在蛋白组学中应用的两性离子改良的突光染料近期已由Dratz和Grieco在 美国专利申请号0259333 A1 (2007年11月）中报道。观察到由两性离子染料标记的蛋白 质是水溶性的并且更顺应电泳分析，并且上述作者已请求保护使用两性离子染料用于蛋白 质分析的方法。
[0016] 现有技术未描述在化学发光吖啶鋒|酯中掺入电学中性、两性离子官能团，以改善 其性质例如非特异性结合。此类化合物补充由Natrajan等人在美国专利号6, 664, 043 B2和美国专利号7, 309, 615 B2中描述的含PEG吖啶鐵酯，并且具有改善测定灵敏度的潜力。
[0017] 本领域存在关于用于免疫测定等的改善化学发光标记的持续需要。因此，本发明 的目的是提供显示出与固相减少的非特异性结合的化学发光吖啶錄t化合物。
[0018] 发明概述
[0019] 依照前述目的及其他，已惊奇地发现通过将两性离子基团掺入分子内以增加其亲 水性且因而减少与固相的非特异性结合，化学发光吖啶備I化合物的性质得到改善。
[0020] 在本发明的一个方面，提供了包含下述的化学发光吖啶縛t化合物：（i)连接至吖 啶養I核的氮原子的烃基团，所述烃基团任选由至多20个杂原子取代，和（ii)与取代的烃部 分连接的、吖啶鐵核的C9位置上的羧基或磺酰胺基团，其中吖啶鐵化合物包含连接至吖啶 铸t核的C2位置、吖啶錄|核的C 7位置、与羧基或磺酰胺基团连接的烃部分、或连接至吖啶隹翁 核的氮原子的烃基团的至少一个两性离子官能团；其中与不包含所述两性离子官能团的在 其他方面等同的吖啶隹貧化合物比较，所述吖啶纖化合物显示出与固相减少的非特异性结 合。
[0021] 在一个实施方案中，化学发光吖啶鐵化合物是具有式I中所示的下述结构的吖啶 镨酯：
[0022]
[0023] 其中，
[0024] &是C i 35烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以含有至多20个杂原子，或横丙基 或磺丁基，或&是基团-R a_Z ;其中Ra是选自q 35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基 团，其各自任选含有至多20个杂原子；
[0025] 私和R3独立地选自（i)氢、（ii)供电子基团或（iii)基团-Z ;
[0026] Z是下述形式的两性离子基团：
[0027]
[0028] X在每次出现时独立地选自键、-ch2-、氧、硫、-nrn-、酰胺（_NRn(C0)_)、氨基甲酸根 (_NR nC (〇)〇-)或脲基（_NRnC(0)NRn_);
[0029] R'和R"在每次出现时独立地选自Q 35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任 选含有至多20个杂原子；
[0030] Zi是基团-Ra_Z2，其中Z2选自羧酸根（-C00 )、磺酸根（_S03 )、硫酸根（_0S03 )、磷 酸根（-〇P(〇) (0R) (〇 ))或氧离子（-0 );或在其中22是氧离子（-0 )的情况下，Ra可以是不 存在的；
[0031] n在每次出现时独立地选自1-12的整数；和
[0032] 心和1?8是相同或不同的，并且选自氧，C i 35烷基、烯基、炔基，烷氧基（_0R)，烧硫基 (-SR)或取代的氨基（_NR2);
[0033] R5、RjP R 7独立地选自氢或基团_ (CO) -R 15，条件是R5、RjP R 7中的2个是氢，并且 R5、&和R 7之一是所述基团-(CO) -R 15;
[0034] R15是基团-Z或基团-X aR*，其中Xa是氧、硫或-NR N_，并且R*选自氢，Q 35烷基、烯 基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任选含有至多20个杂原子，或R*是基团-Ra-L，其中L是用 于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物的离去基团；条件是当 R 15是基团-Z时，那么X在每次出现时独立地选自键、-CH 2_、氧、硫或-NRn-;
[0035] R在每次出现时独立地选自Q35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多 20个杂原子；和
[0036] #在每次出现时独立地选自氢，Ci 35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有 至多20个杂原子；
[0037] 条件是1^、1?2、1?3、1?5、1? 6和1?7中的至少一个是基团2。
[0038] 在另一个实施方案中，化学发光吖啶#翁化合物是具有式II中所示的下述结构的 吖啶铺磺酰胺：
[0039]
[0040]其中，
[0041] &是Ci35烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以含有至多20个杂原子，或横丙基 或横丁基，或Ri是基团 _R a_Z ;
[0042]私和R3独立地选自⑴氢、（ii)供电子基团或（iii)基团_Z;
[0043] Y和Y'独立地选自R、-Ra_Z或-Ra-L;其中L是包含离去基团、亲电子基团或亲核 基团的可衍生官能团，用于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合 物；
[0044] Z是具有下述形式的两性离子基团：
[0045]
[0046] X在每次出现时独立地选自键、-CH2_、氧、硫、-NR"-、酰胺（-NRN(CO)-)、氨基甲酸 根（-NRNC(0)0-)或脲基（-NRNC(O)NRN-);
[0047] R'和R"在每次出现时独立地选自Q35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含 有至多20个杂原子；
[0048] Zi是基团-Ra_Z2，其中Z2选自羧酸根（-C00 )、磺酸根（_S03 )、硫酸根（_0S03 )、磷 酸根（-0P(0) (0R) (〇 ))或氧离子（-0 );或在其中22是氧离子（-0 )的情况下，Ra可以是不 存在的；
[0049] n在每次出现时独立地选自1-12的整数；
[0050] R在每次出现时独立地选自Q35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多 20个杂原子；
[0051] #在每次出现时独立地选自氢，C135烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有 至多20个杂原子；
[0052] 并且Ra是选自Ci35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基团，其各自任选含有 至多20个杂原子；
[0053] 条件是&、R2、R3、Y和Y'中的至少一个是所述两性离子基团Z。
[0054] 在本发明的另一个方面，提供了用于检测分析物的试剂，其包含与分析物、分析物 类似物或关于分析物的结合配偶体结合的化学发光吖啶爾化合物，所述吖啶II化合物包含 (i)连接至吖啶働核的氮原子的烃基团，所述烃基团任选由至多20个杂原子取代，和（ii) 与取代的烃部分（任选由至多20个杂原子取代）连接的、吖啶懿t核的仏位置上的羧基或 磺酰胺基团，其中所述吖啶鐵化合物包含连接至吖啶核的C2位置、吖啶鐵核的C7位置、 与羧基或磺酰胺基团连接的烃基团、或连接至吖啶铸t核的氮原子的烃基团的至少一个两性 离子官能团；其中与不包含所述两性离子官能团的在其他方面等同的吖啶德t化合物比较， 所述吖啶鐵化合物显示出与固相减少的非特异性结合。
[0055] 在本发明的一个进一步方面，提供了用于检测或定量大分子分析物的测定，其包 含：(a)提供包含根据本发明的化学发光吖啶鋒|化合物的缀合物，所述化学发光吖啶铸|化 合物与对于分析物特异性的结合分子结合；(b)提供具有在其上固定了对于所述分析物特 异性的第二种结合分子的固体载体；（c)混合缀合物、固相和怀疑含有分析物的样品以形 成结合复合物；（d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；(e)通过加入化学发光触发试 剂，触发来自步骤（d)的结合复合物的化学发光；（f)用光度计测量光发射的量；和（g)通 过比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的 浓度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
[0056] 在另外一个方面，提供了用于检测或定量小分子分析物的测定，其包含下述步骤： (a)提供分析物与根据本发明的化学发光吖啶隹賞化合物的缀合物；(b)提供固定有对于分 析物特异性的结合分子的固体载体；（c)混合缀合物、固体载体和怀疑含有分析物的样品 以形成结合复合物；(d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；（e)通过加入化学发光触 发试剂，触发来自步骤（d)的结合复合物的化学发光；（f)用光度计测量光量；和（g)通过 比较由反应混合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓 度，所述标准剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
[0057] 在另外一个方面，提供了用于检测小分子分析物的测定，其包含：(a)提供固定有 分析物或分析物类似物的固体载体；(b)提供对于分析物特异性的结合分子与根据本发明 的化学发光吖啶镯|化合物的缀合物；(C)混合固相、缀合物和怀疑含有分析物的样品以形 成结合复合物；（d)分离在固体载体上捕获的结合复合物；(e)通过加入化学发光触发试 剂，触发⑷的结合复合物的化学发光；（f)用光度计测量光量；和（g)通过比较由反应混 合物发射的光量与标准剂量应答曲线，检测分析物的存在或计算分析物的浓度，所述标准 剂量应答曲线使发射的光量与分析物的已知浓度联系。
[0058] 本发明的这些及其他方面通过参考下述详述包括附加权利要求将得到更佳理解。
[0059] 附图简述
[0060]图1提供了本发明的多个示例性含两性离子的吖啶鐵化合物的化学结构。
[0061]图2提供了本发明的其他示例性含两性离子的吖啶鐵化合物的化学结构。
[0062]图3提供了本发明的另一个示例性含两性离子的吖啶纖化合物的化学结构。
[0063] 图4是作为时间函数标绘的，以相对光单位百分比（RLUs)表示的由对照 (NSP-DMAE-HEG)和示例性含两性离子的吖啶鐵（NSP-DMAE-Z-NHS)缀合物发射的光的曲线 图。
[0064] 图5是作为时间函数标绘的，以相对光单位百分比（RLUs)表示的由对照（HQYAE) 和与2种抗体的示例性含两性离子的吖啶鐵（NSP-2,7-DMG-DMAE)缀合物发射的光的曲线 图。
[0065]图6是作为时间函数标绘的，以相对光单位百分比（RLUs)表示的由对照 (NSP-DMAE-Z)和与抗TSH Mab的示例性含两性离子的吖啶鐵（ZC6M-AE和ZC8M-AE)缀合 物发射的光的曲线图。
[0066] 发明详述
[0067] 本发明的主要目的是公开含两性离子的吖啶轉|化合物的结构，当与缺乏这些结构 特征的吖啶锡化合物比较时，其展示出与固相的低非特异性结合。本发明的另一个目的是 公开吖啶镑|化合物的2类两性离子修饰：(a)在吖啶铸|环中含有两性离子的吖啶备翁化合 物，和（b)含有连接至苯酚离去基团的两性离子的吖啶隹翁化合物。本发明的另一个目的是 公开当与不含这种结构修饰的吖啶鐵化合物比较时，来自具有连接至苯酚的两性离子的吖 啶奢翁化合物的出乎意料更快的光发射。本发明的另外一个目的是证实含两性离子的吖啶 鶴化合物与不含两性离子的吖啶铜I化合物一样稳定，并且具有可比较的量子产率。
[0068] 根据本发明的化学发光吖啶織化合物可以是吖啶鐵酯、吖啶縛|磺酰胺等。在一个 实施方案中，化学发光吖啶鐵化合物包含（i)连接至吖啶it核的氮原子的烃基团，所述烃 基团任选由至多20个杂原子取代，和（ii)与取代的烃部分连接的、吖啶傳|核的C9位置上 的羧基或磺酰胺基团，其中吖啶镥化合物包含连接至吖啶鐵核的(： 2位置、吖啶鐵核的(：7位 置、与羧基或磺酰胺基团连接的烃部分、或连接至吖啶鐵核的氮原子的烃基团的至少一个 两性离子官能团；其中与不包含所述两性离子官能团的在其他方面等同的吖啶鐵化合物 比较，所述吖啶織化合物显示出与固相减少的非特异性结合。
[0069] 连接至氮原子的烃基团任选由至多20个杂原子取代，并且因此自身可以构成两 性离子基团，例如在磺丙基或磺丁基连接的环氮的情况下，其中存在在环季氮上的正电荷 和在103基团上的负电荷。应当理解即使存在此类两性离子基团，根据本发明的化合物也 将另外包含至少一个两性离子基团。换言之，根据本发明的化合物将包含在除吖啶鐵核的 氮或加上吖啶f翁核的氮的原子上的正电荷。
[0070] 在一个实施方案中，化学发光吖啶锋|化合物是具有式I中所示的下述结构的吖啶 镭酯：
[0071]
[0072] 其中，
[0073] &是C i 35烷基、烯基、炔基或芳烷基，其各自可以含有至多20个杂原子，或横丙基 或磺丁基，或&是基团-R a_Z ;其中Ra是选自q 35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基 团，其各自任选含有至多20个杂原子；
[0074] 私和R3独立地选自⑴氢、（ii)供电子基团或（iii)基团-Z ;
[0075] Z是下述形式的两性离子基团：
[0076]
[0077] X在每次出现时独立地选自键、-ch2-、氧、硫、-nrn-、酰胺（_NRn(C0)_)、氨基甲酸根 (_NRnC (〇)〇-)或脲基（_NRnC(0)NRn_);
[0078] R'和R"在每次出现时独立地选自Q 35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任 选含有至多20个杂原子；
[0079] Zi是基团-Ra_Z2，其中Z2选自羧酸根（-C00 )、磺酸根（_S03 )、硫酸根（_0S03 )、磷 酸根（-〇P(〇) (0R) (〇 ))或氧离子（-0 );或在其中22是氧离子（-0 )的情况下，Ra可以是不 存在的；
[0080] n在每次出现时独立地选自1-12的整数；和
[0081] 心和1?8是相同或不同的，并且选自氧，C i 35烷基、烯基、炔基，烷氧基（-0R)，烧硫基 (-SR)或取代的氨基（_NR2);
[0082] R5、RjP R 7独立地选自氢或基团_ (CO) -R 15，条件是R5、RjP R 7中的2个是氢，并且 R5、&和R 7之一是所述基团-(CO) -R 15;
[0083] R15是基团-Z或基团-X aR*，其中Xa是氧、硫或-NR N_，并且R*选自氢，Q 35烷基、烯 基、炔基、芳基或芳烷基，其各自任选含有至多20个杂原子，或R*是基团-Ra-L，其中L是用 于与分析物、分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物的离去基团；条件是当 R 15是基团-Z时，那么X在每次出现时独立地选自键、-CH 2_、氧、硫或-NRn-;
[0084] R在每次出现时独立地选自Ci 35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有至多 20个杂原子；和
[0085] #在每次出现时独立地选自氢，C i 35烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其各自含有 至多20个杂原子；
[0086] 条件是1^、1?2、1?3、1?5、1? 6和1?7中的至少一个是基团2。
[0087] 在一个实施方案中，&、R2、私和1?6中的至少一个或确切地一个包含基团-L 或-Ra-L，其中L是包含离去基团、亲电子基团或亲核基团的可衍生官能团，用于与分析物、 分析物类似物或关于分析物的结合配偶体形成缀合物。在某些实施方案中，L将选自：
[0089] 在某些实施方案中，R15将选自：
[0090] (1)-OH ；
[0091] (2) -0-N-琥珀酰亚胺基；
[0092] (3) -NH- (CH2) 5_C (0) -0-N-琥珀酰亚胺基；
[0093] (4) -NH- (CH2) 5-COOH;
[0094] (5) -NH- (C2H40)「C2H4NH-C (0)-(CH2) 3-C (0) -0-N-琥珀酰亚胺基，其中 i=1-5;
[0095] (6) -NH- (C2H40)(0)-(CH2) 3-C00H，其中 i=1-5;
[0096] (7)-順_((：21140) 1-(：2114順2，其中1 =