(ThermoScientific,Wilmington,DE0 ;BDH度DH 化学品，从VWRInternational,liX,Ra化or,PA可得）；Roche(RocheApplied Science,Pleasanton,CA) ;FI0PC(超过阳性对照的成倍改进）；ARS(ARS培养物保 藏或NRRL培养物保藏，Peoria,IL) ;ATCC(Ame;ricanTypeQiltureCollection, Manassus,VA) ；ADM(ArcherDanielsMidland,Decatur,IL) ；Axygen(Axygen,Inc.,Union City,CA) ;GenScript(GenScript,USAInc. ,Piscataway,NJ) ；CGSC(E.coli GeneticStockCenter，YaleUniversity,NewHaven,CT) ;HE防CULASE較是AgilentTechnologies(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)白勺注册商标；Dual Biosystems(DualBiosystemsAG,Schlieven,Switzerland) ;Megazyme(Megazyme InternationalIreland,Ltd.，Wicklow,Ireland) ；Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO) ；BASF(BASFAktiengesellschaftCorp.，Ludwigshafen,DE) ；Dasgip(Dasgip Biotools，LLC,Shrewsbury,MA) ;Difco(DifcoLaboratories,BDDiagnostic Systems,Detroit,MI);PCR诊断法巧CR诊断法，由EcoliSRO,SlovakRepublic); Agilent(AgilentTechnologies,Inc.，SantaClara,CA);MolecularDecives(Molecular Decives，Sunnyvale,CA);Symbio(Symbio,Inc.，MenloPark,CA) ;Newport(Newport Scientific,Australia) ;Bi0-民ad(Bio-民adLaboratories,Hercules,CA) ;Qiagen(Qiagen SciencesInc.，Germantown,MA) ；Zymo(ZymoResearchCorporation,Irvine,CA); Promega(PromegaCorporation,Madison,WI) ;Invitrogen(Invitrogen,Inc.，Carlsbad, CA);NEB(NewEnglandBioLabs,Ipswich,M) ;Sensient(SensientBio-Ingredients，Ind ianapolis,IN);AlfaAesar(AlfaAesar,WardHill,MA) ；Calbiochem(EMDBiosciences Inc.，SanDiego,CA)；Mal1inckrodt(Mai1inckrodtBakerInc.St.Louis,MO,现在 AvantorPerformanceMaterials,CenterValley,PA);JTBakerMallinckrodtBaker Inc.，St.Louis,MO，现在AvantorPerformanceMaterials,CenterValley,PA);Corn Products(CornProductsInternational,Stockton,CA);RichmanChemical(民ichman ChemicalInc.，LowerGwynedd,PA) ;0mnipur(Omnipur，Caldwell,ID;从EMDBiosciences Inc.，SanDiego,CA可得）；AMRESCO(AMRESCOUX，Solon,OH) ;Michrom(Michrom Bioresources，Inc.，Auburn，CA) ；LB(Luria-Bertani) ；LA(Luria-Bertani琼月g) ；S0C(具 有分解代谢物阻遏的SuperOptimaU夜体培养基）；和TB(TerrificBro化）。
[0123] 一种用于定量总脂肪醇的方法，并通过在F15B-8巧OC转子中，在6000巧111下，离屯、 持续10分钟来收集使用不同链长的每个细胞。将细胞团重悬在0. 5mL的6. 7%Na^SO^中， 并且然后用ImL异丙醇：甲基叔下基離（4/6比率）提取持续2小时。对提取物离屯、并直 接地通过GC-門D或GC-MS分析或在分析之前用BSTFA衍生化。为了衍生化，对400UL样 品移去顶部有机层，在氮气流下蒸发并在37它下用100uLN，〇-二（兰甲基娃烷基）兰氣乙 醜胺化STFA)对残留物衍生化持续1小时，并且然后在通过GC-門D或GC-MS分析之前，用 100UL庚焼稀释。还用ImL甲基叔下基離对0.5mL培养基（在通过离屯、去除细胞之后）提 取持续Ihr。有机相直接地通过GC-門D或GC-MS分析或在分析之前如上描述的用BSTFA 衍生化。另外，直接地用ImL异丙醇：己焼（4:6的比率）对0. 5mL细胞培养物（在通过离 屯、去除细胞之前）提取持续2小时。有机相直接通过GC-門D或GC-MS分析或在分析之前 如上描述的用BSTFA衍生化。
[0124] 利用下条件通过GC-門D用分流比1:10来分析1化样品：来自Agilent Technologies的装备有門D检测器和HP-5柱（长30m，I.D. 0? 32mm，薄膜0? 25um)的 GC-6890N。GC方法lOCrC开始，25它/min的速率将温度增加到246它并保持持 续1.96min。总的运行时间，7.8min。在上GC条件下，产生的脂肪醇和酸的大概的 保留时间如下：5. 08，C14:0-0H;5. 40;C14:0-00H;5. 74，C16:1-0H;5. 93，C16:0-0H; 6.11，（：16:0-0016(内部标准）；6.16，（：16:1-0(^;6.29，（：16:0-0(^;6.80，（：18:1-(?; 6. 90，C18:0-0H;7. 3，C18:0-和C18:1-00H。通过与商业标准（Sigma)相比完成个体脂肪醇 的鉴定。
[0125] 实施例1
[0126] 设计并克隆合成的启动子化〇1
[0127] 该实施例描述了包含两个化oB结合位点（PhoB框）的大肠杆菌合成启动子的设 计和克隆。在该构造中，运些化oB框中的一个与启动子的-35区重叠，在本文中该化oB框 被称为"化〇1启动子"。该设计包含的其他特征包括：上游转录终止子W使启动子与上游启 动子的转录隔绝；共有的-35和-10区W增强RNA聚合酶结合；源于来自rrnB基因的P1启 动子的27bpW促进转录起始；源自rrnB基因的7化P，包含抗-终止信号；包含信号的73bp W增强信使RNA的翻译；和与lacI-LacZ基因同源的区域。
[0128]W下提供了合成启动子的DNA的核巧酸序列：
[0130] 合成该合成DNA并通过GenScript在eJETI-2质粒中克隆入EcoRV位点。
[0131] 实施例2
[0132] 构建DNAS盒W用化〇1启动子控制f油B
[0133] 该实例描述了用化〇1启动子控制化bB的DNAS盒的构建。该启动子盒被设计通过 用卡那霉素-Phol启动子盒置换化bB原始调控区来基于培养基中的憐酸盐水平调节化bB 的表达水平。该盒包含与大肠杆菌化bB基因同源的区域的40bp和3化P，W及化〇1启动 子和侧翼为FLP重组酶祀位点（"FRT位点"）的卡那霉素抗性基因，如图2所显示的。FRT 位点的存在有利于Km标志物通过FLP重组酶的作用移除。
[0134] 利用在实施例1中描述的rJETI中克隆的化01-启动子，通过3步骤PCR组装该 盒。W下引物和条件被用于获得该盒。
[0135] 在第一步骤中，使用包含与卡那霉素盒（包含FRT位点）同源的33个碱基的正向 寡核巧酸（5'CDX-PholF)(SEQIDN0:9)W及包含与原始f油B核糖体结合位点RBS和F油B 染色体基因的5'序列同源的40个碱基的反向寡核巧酸（3'CDXPhoR)(SEQIDN0:10)。 W下显示了序列。预期的PCR产物长度为340个碱基对。
[0136] 5'CDX-PholF:AGTATAGGAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACAAATAAAAAT GCCAGCCGATCGGGCTGG(SEQIDNO：9)
[0137] 3'CDXPhoR:TCATTCAATACCTCTGTAAGTCGCACATAGAGTAAGTTTCTG GTGGCGCATTATACCAGC佛QIDNO:10)
[0138] PCR方案使用：
[0139] 模板(10ng/!j.l) Ijil 5x HF PHUSION嚴缓冲液 10川 lOmM dNTPs lj.il DM SO 2jil 正向寡板普酸1{j1反向寡枯普酸20|iM 1叫 PHUSION⑥聚合酶口U/烛 0.5jil 邱0 33.5!il 总体积 50|j1
[0140] 使用的PCR条件是98°C持续2分钟，1个循环，之后是98°C持续10秒、60°C持续 15秒、W及72°C持续20秒钟，30个循环，然后是72°C持续2分钟的最终循环。
[0141] 在第二步骤中，使用W下引物从地D13质粒PCR扩增卡那霉素盒。正向寡核巧酸 巧'Kan巧（SEQIDNO: 11)包含与整合位点的上游序列同源的35个碱基并且反向寡核巧 酸（3'Kan时（SEQIDNO: 12)包含与化〇1的5'序列同源的35个碱基。预期的PCR产物 的长度为1380个碱基对。
[0142] 5,KanF:AGGCGGTGGCTCGATCTTAGCGATGTGTGTAAGGCTGCGCATTCC GGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO： 11)
[0143] 3,KanR:AAAGGCAAAAATGCCAGCCCGATCGGCTGGCATTTTTATTTGTAG GCTGGAGCTGCTTCG(沈QIDNO: 12)
[0144] PCR方案使用：
[0145] 模板(10打g/|il) Ijil 5x HF脚肋熟ON?缓冲猿 10,Ltl lOmM dNTPs 叫 DM SO 2pl 立向寡核普酸2卽M Ijil
[0146] 反向寡接菩酸2〇,uM： 1川 PHUSION?聚合酶(2U/|_il) 0.5|il H2O 33.5j.ll 总体积 5(仙
[0147] 使用的PCR条件是98°C持续2分钟，1个循环，之后是98°C持续10秒、60°C持续 15秒、和72°C持续20秒，30个循环，然后是72°C持续2分钟的最终循环。
[0148] 在步骤3中，将来自之前两个步骤的两种PCR产物凝胶纯化，并将其用作模板W在 拼接重叠和延长PCR(SOE)中使用W下寡核巧酸组装最终的整合盒。最终的盒长度是1650 个碱基对。
[0149] 5,KanF:AGGCGGTGGCTCGATCTTAGCGATGTGTGTAAGGCTGCGCATTCC GGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO:11)
[0150] 3'CDXPhoR:TCATTCAATACCTCTGTAAGTCGCACATAGAGTAAGTTTCTG GTGGCGCATTATACCAGC佛QIDNO: 10)
[0151]PCR方案使用：
[0152] 模板(每种PCR产物1 Ong) \ix\ 5x HF PHUSION處缓冲液 lOjil lOmM dNTPs Ijil DMSO 2jii 正向寡杖普酸2〇|iM ljj,i 反向寡板菩酸2()|iM l)ii PHUSION饭聚合酶aU4il) a5jil H，0 33 5|il 总体积 50|il
[0153] 所使用的PCR条件是98°C持续2分钟，1个循环，之后是98°C持续10秒、65°C持续 15秒、和72°C持续1分钟，30个循环，然后是72°C持续2分钟的最终循环。在该反应之后， 纯化PCR产物并通过PCR纯化柱（Qiagen)脱盐并用水洗脱。
[0154]W下显示了最终的盒的DNA序列。W粗体显示与染色体同源的区域：
[0156] 实施例3
[0157] 构建具有在化〇1启动子的控制下的化bB的菌株
[015引该实例描述了具有在化01启动子的控制下的fabB的大肠杆菌菌株的构建。在该 构建体中，如W下描述的，将实施例2中描述的盒用于替换大肠杆菌菌株W3110K(CGSC)的 染色体中的F油B基因的原始调控区。
[0159] 首先，制备重组酶诱导的细胞。使用包含质粒PSIM5的菌株W3110K的单克隆（参 见，0曰的曰等人，66116 379:109-115巧006])接种311111^8培养基值1'(3〇)+30^邑/1111^氯霉素 并在30°C下过夜培养。将350yL该过夜培养物添加到250ml带有挡板的化affled)锥形 烧瓶中的40mLTB培养基值ifco)+30yg/mL氯霉素（被预热到30°C)。在30°C下伴随W 250巧m的摇动使细胞生长持续2小时45分钟（~0. 5的0D600)。将烧瓶立即转移到42°C 水浴，并伴随W3(K)巧m的摇动解育持续12分钟（该步骤确保重组酶已被诱导）。紧接着 诱导，使培养物在冰水中迅速冷却并留在冰上持续5-10分钟。经诱导的培养物被转移到预 冷却的离屯、管中并在4°C、~4000Xg下离屯、持续lOmin。吸去上清液并将1ml冰冷的无菌 蒸馈&0添加到细胞团W重悬细胞，在重悬之后，添加另外的40ml冰冷的蒸馈&0。如在之 前的步骤中的，再次离屯、离屯、管（即，在4°C、~4000Xg下lOmin)。轻轻倒出得到的40ml 上清液并在1ml冰冷的蒸馈&0中重悬细胞团。将细胞转移到预冷却的微量离屯、管中并在 4°C冷却的微型离屯、机中W~l〇,〇〇〇xg离屯、持续Imin。吸去上清液并再一次重复洗涂步 骤。在~250y1无菌冰冷的蒸馈&0中重悬得到的细胞团并保持在冰上，直到使用。
[0160] 然后，通过将1y1到10y1 (~10化g)无盐PCR片段用移液管移入至在步骤1中 制备的50 电转化感受态细胞来进行线性PCR产物到重组酶诱导的细胞的电转化。将细 胞和DNA混合物转移到在冰上的1mm比色杯并在1. 7kV下电穿孔。紧接着电转化，在新的 无菌离屯、管中将细胞在2血SOC培养基（Invitrogen)中重悬。然后，将离屯、管在37°C下解 育持续~3小时，W允许完成药物耐受基因的重组和表达。
[0161] 解育之后，针对阳性整合体选择细胞。在该过程中，将W上描述的~3小时的解育 之后得到的100y1培养物接种到具有20yg/血卡那霉素的琼脂平板上。另外，使ImL细胞 停止旋转，在100y1LB中重悬并接种到具有40yg/mL卡那霉素的LA值ifco)平板上。在 37°C下过夜解育平板。观察到每100y1培养物约~20个克隆。
[0162] 解育之后，进行适当的基因组修饰的证实。在该步骤中，将来自上述平板的克隆划 线接种至非选择LB平板上，W产生单克隆。通过PCR和测序来验证来自非选择平板的十二 (12)个克隆。两个合成寡核巧酸被用于扩增fab调控区（如W下显示的，FB基因组-上和 FB基因组-下）。运些寡核巧酸为位于染色体中的改变的区域的上游或下游的约250个碱 基。该PCR产物的预期大小是3227bp。
[016引 FB基因组-上：TTGGAAAAATAGACATCGTCAAAATCTC(沈QIDN0:14)
[0164]FB基因组-下：TGCAGCGCAAGGCGAGGAGTATCCCCGTCT(沈QIDN0:15)
[0165] PCR方案使用：
[0166] 模板(溶于成0中的克隆） 1灿 5x HE民CULA化嚴II反应缓冲液 10川 IQmMdNTPs Ijil 甜莱碱5M lOjil 正向寡板菩酸20^lM 1如 反向寡枯普聽绒jiM: 1|4 HE民CULASE底II Fusion DNA 聚合0 5)^1 酶(2U/|il) H，0 25.5'lU 总体积 50|j1
[0167] 所使用的PCR条件是95°C持续2分钟，1个循环，之后是95°C持续20秒、60°C持续 30秒、和72°C持续3分钟，30个循环，然后是72°C持续2分钟的最终循环。
[016引利用W下引物对获得的PCR产物充分测序：
[0169]
[0170] 实施例4
[0171] 通过qPCR分析F油BmRNA
[0172] 在该实施例中，描述了利用qPCR进行W量化在实施例3中产生的菌株产生的化bB mRNA的水平的实验。在运些实验中，材料包括RNeasyMini试剂盒（Qiagen)、RNAprotect BacterialReagent(Qiagen)、琉基乙醇、乙醇、溶菌酶（Sigma)、蛋白酶K(Qiagen)、无RNA 酶的DM酶集合（Qiagen)、
[0173]Zym〇-RNAcleanandconcentrator-S狂ymo)、ImProm-II逆转录系统（Promega)、 Li曲t切cler480SYBRGreenMasterMix(Roche)和qPCR引物。
[0174] 在该方案中，通过将培养物的样品直接地添加到具有2体积RNAprotect bacterialreagent的管中来制备RNA。混合内容物并在RT下解育持续5分钟。通常，在~ 0. 5-0.8的诱导0D下，获取约1-1. 5血的等份并在稍后的时间点取样~0. 25-0. 4血。在 5000xg下对每个样品离屯、持续lOmin并轻轻倒出上清液。运时，在-80下冷冻或直接地用 于RNAMini试剂盒。
[0175] 首先，如RNeasy手册的方案4中所指导的（细菌的酶促裂解和蛋白酶K消化） 制备RNA。利用Nano化op2000仪器（Thermo)定量RNA。接下来，通过溫和的混合将固 体粉末溶于550uL水中来制备DNA酶1存储液并将其分成50uL等份，将50uL等份存储 在-20°C，直到使用。DNA酶反应使用《加gRNA、3uL畑D缓冲液、luLDNA酶1和足够提供 30uL溶液的水。将溶液在37°C下解育持续30min。然后，添加另外的luLDNA酶并将溶液解 育又一 30min。添加另外的lulDNA酶并将溶液解育持续1小时。按照制造商的指示，利用 Zymo-RNAcleanandconcentrator-S清洁反应并且然后在20uL水中洗脱。利用Nano化op 2000仪器灯hermo)定量RNA并将终浓度调整到25ng/ul。
[0176] 接下来，利用Improm-II逆转录试剂盒?(P;romega)合成cDNA，用于在qPCR中使 用。在该程序