工作台（ARITECH日本）， 微量移液器值ragon芬兰），酶标仪度io-RAD德国），流式细胞仪度DAc州riC6美国）。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、细胞培养及传代
[0032] 人胶质母细胞瘤细胞系U251培养在含10%胎牛血清、1 %青霉素、1 %链霉素的 DMEM高糖培养基中，于37°C，5%C〇2培养箱中常规培养，每隔2天予更换新鲜培养基。待 细胞融合至80%左右后，吸除培养基，并用预热的无菌憐酸酸盐缓冲液洗3次，然后向培养 皿中加入含0. 25%族蛋白酶及0. 02%邸TA的细胞消化液ImL消化约2分钟，光镜下观察 细胞，可见细胞逐渐回缩变圆，胞间间隙变宽，此时移除细胞消化液，加入完全培养基4mL 终止消化，ImL枪头轻柔吹打制成细胞悬液，低速离屯、机lOOOrpm离屯、5分钟，吸除上清液， 加入完全培养基重悬，轻柔吹打均匀后，根据经验按1:3~1:5传代，传代后的细胞置于培 养箱中继续培，约每周传代2次，W保持细胞处于对数生长期。细胞计数方法：细胞计数板 擦拭干净，并将盖玻片盖在计数板上；将细胞悬液沿盖玻片边缘缓慢滴入计数板，光镜下观 察，细胞透明、折光性好为活细胞，计数4个大方格中的活细胞数。每细胞数=每个方格中 活细胞数平均值X稀释倍数X104。
[0033] 2、CCK-8检测细胞生存率
[0034] 取对数生长期的U251细胞，用含邸TA的0.25 %膜酶消化吹打细胞制成单细胞悬 液并计数，用完全培养基调整细胞浓度约2X104个/mU将细胞接种于96孔培养板中，每 孔100 置于37°C、5%C〇2培养箱中培养12小时，吸除原培养基，按分组给予不同处理： 空白对照组（等量完全培养基），化合物（I)组设l、2、4mmol/l，每组设=个重复孔，无菌 PBS封闭周边各孔，再次置于37°C、5% %培养箱中，分别培养24、48、72小时后取出96孔 板，吸除各组原有培养基，更换为100yLDMEM培养液，本底组无细胞只有DMEM培养液。每 孔加入lOyLCCK-8溶液，置于培养箱中继续培养2小时。用全自动酶标仪测定每孔吸光 度值（0D值），波长设定在450mn处，取每组复孔的均值。上述实验步骤重复3次，计算平 均值。细胞生存率计算公式如下：细胞生存率=(实验组0D值-本底组0D值）/(对照组 0D值-本底组0D值）X100%，绘制生长抑制曲线图，并作统计学分析。
[0035] 3、Hoechst33258 染色
[0036] 实验采用碧云天公司化echst33258染色液，细胞发生调亡时，会看到调亡细胞的 细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。根据细胞生存率结果，选取2mmol/L化合物（I ) 作用48小时作为化echst 33258染色的条件。将细胞消化、离屯、、计数，调整细胞浓度后种 入24孔板中，置于37°C、5%C〇2培养箱中培养12小时，吸除原有培养基，按分组给予不同 处理：空白对照组（等量完全培养基），化合物（I)组设l、2、4mmol/l，无菌PBS封闭周 边各孔，再次置于37°C、5% C〇2培养箱中，继续培养48小时后取出24孔板，吸除各组原有 培养基，无菌PBS洗3次，每孔加入0. 5mL多聚甲酸固定细胞15分钟，PBS洗3次，各孔加 入100yL化echst 33258染色液，室溫黑暗环境下染色lOmin，去染色液，PBS摇床晃动冲 洗3次，每次5分钟，洗尽液体，每孔滴加一滴抗巧光泽灭液，340nm波长的巧光显微镜下拍 照并观察细胞核形态学变化。 阳037] 3、流式细胞术检测细胞循亡
[0038] 根据细胞生存率结果，选取48小时作为检测细胞稠亡的特定时间点。取处于对 数生长期且状态良好的U251细胞，按常规消化传代，接种于6孔板内37°C、5%C〇2培养箱 中解育12h，按分组给予不同处理：空白对照组（等量完全培养基），化合物（I)组设1、 2、4mmol/l，置于37°C、5%C〇2培养箱中继续培养48小时后，将原有培养液洗至5血离屯、 管中，PBS洗涂贴壁细胞2次，加入含有邸TA的适量膜酶消化细胞。室溫解育至轻轻吹打 可W使贴壁细胞吹打下来时，尽量吸尽膜酶细胞消化液。加入收集的原有细胞培养液，稍 混匀，转移到5血离屯、管内，lOOOg离屯、5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并 计数。取5万个重悬的细胞，lOOOg离屯、5分钟，弃上清，加入100yLAimexinV-門TC结合 液轻轻重悬细胞。加2mLAnnexinV-門TC，轻轻混勾。室溫避光辉育10分钟。lOOOg离屯、 5分钟，弃上清，加入2yL舰化丙唆染色液，轻轻混勾，冰浴避光放置15min。随即进行流 式细胞仪检测，AmexinV-FITC为绿色巧光，PI为红色巧光。记录AnnexinV-門TC+PI+和 AnnexinV-門TC+PI-作为调亡细胞，每次计数10000个细胞，计算各组调亡率。
[0039] 4、统计学处理
[0040] 采用SPSS16. 0进行统计学分析，实验所有数据均代表3次重复实验的结果，W均 数±标准差表示。生存率的组间比较采用析因设计资料的方差分析，细胞调亡率的组间比 较采用单因素方差分析，检验水准为a= 0. 05,P<0. 05为有显著性差异，P<0. 01为极有显 著性差异。
[0041]S、结果及结论
[0042] 1、化合物（I)对U251细胞生存率的影响
[0043] 化合物（I)抑制U251细胞存活生长CCK-8实验结果显示，不同浓度化合物（I) 作用U251细胞后，随着作用浓度増高，作用时间加长，U251细胞生存率明显下降，方差分 析显示化合物（I)浓度因素的主效应F= 945.8(P<0.01);作用时间因素的主效应F= 302. 67 (P<0. 01)，浓度、时间因素的交互作用F= 45. 7 (P<0. 01)。结合表1，可发现化合物 (I)对U251细胞生存率的抑制作用呈时间、剂量依赖性，即化合物（I)浓度越高，作用 时间越长，其抑制作用越强。通过计算得出化合物（I)作用24h、48h、72h的ICs。值分别 为，3. 67mmol/L、1. 37mmol/L、1. 09mmol/L。
[0044] 2、化合物（I)对U251细胞稠亡形态学的影响
[0045] 正常组及化合物（I)处理组细胞经化chest33258染色，巧光显微镜下观察可见 对照组细胞核形态规则，且呈淡蓝色均匀着色；而经2mmol/L化合物（I)处理48小时后， 与对照组相比，细胞核出现不同程度的固缩，颜色较为明亮，染色致密浓染，核碎裂明显，且 可见典型的调亡小体。W上细胞核形态学的改变提示化合物（I)有诱导U251细胞调亡 作用。
[0046] 3、化合物（I)对U251细胞调亡率的影响
[0047] 对照组及各处理组经AnnexinV-門TC/PI染色后行流式细胞术检测，结果显示： 对照组、Immol/L化合物（I)、2mmol/L化合物（I)和4mol/L化合物（I)处理48小时 组细胞调亡率分别为3. 30 + 0. 98、14. 97 + 2. 67、27. 53 + 5. 51和55. 90 + 5. 1%。与对照组 相比，各处理组细胞的调亡率显著增加（P<〇. 01)。结果见图3。
[0048] 结论：化合物（I)通过抑制细胞增殖及诱导细胞调亡发挥对人脑恶性胶质母细 胞瘤U251细胞的抑制作用。运些发现为化合物（I)治疗胶质瘤的临床药物研究提供依 据。 W例表1不同浓度化合物（I)处理作用24~72h后U251细胞生存率（均数+标 准差） 阳化0]
阳0川 实施例3
[0052] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。 阳〇5引 实施例4
[0054]口服液制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。 阳〇5引 实施例5
[0056] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0057] 实施例6
[0058] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0059] 实施例7
[0060] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，揽拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安飯中，低溫冷冻干燥后无菌 烙封得粉针剂。
[0061] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：(a)将 白背叶的干燥叶粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石 油酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇 萃取物；化）步骤（a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积， 再用80 %乙醇洗脱10个柱体积，收集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物浸膏； (C)步骤化）中80 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、12:1 和1:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（C)中组分4用正相硅胶进一 步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e) 步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水 溶液等度洗脱，收集10~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流 提取采用的乙醇浓度为85 %。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗神经胶质瘤的新二萜化合物。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜类化合物，可以从白背叶的干燥叶中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡发挥对人脑恶性胶质母细胞瘤U251细胞的抑制作用，这些发现为化合物(Ⅰ)治疗神经胶质瘤的临床药物研究提供依据，可以用来开发成治疗神经胶质瘤的药物。
【IPC分类】A61K31/365, A61P35/00, C07D307/92
【公开号】CN105198845
【申请号】CN201510648388
【发明人】吴正锋
【申请人】吴正锋
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月9日