TP MixUire(2. 5mM) 5yL;Taq(抓/yL) 1yL，F27 (10ymol/L) 1yLR1492 (10ymol/L) 1yL; HMB27703 的基因组DM50ng;d地2〇 补足至 50yL。PCR的反应条件为 95°C5min;95°C30s， 55°C30s，72°C1. 5min，30个循环；72°ClOmin。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上 海生工生物工程有限公司测序，得到HMB27703的16SrDNA序列（见SEQIDNo:3)。将所 得HMB27703的16SrDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB27703与芽抱杆 菌属的16SrDNA同源性达到99% ;构建系统发育树（见图1)，HMB27703与芽抱杆菌属聚 合到一起，说明HMB27703属于芽抱杆菌属度acillus)。
[0042] (3)利用gy巧基因序列鉴定分类
[0043]WHMB27703基因组DNA为模板，利用芽抱杆菌gy巧基因简并引物gy巧-F和 gy巧-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gy巧-F和gy巧-R引物的序列 为：
[0044]gyrB-F:5，TTGRCGWRGYGGHTATAAAGT3，；6EQIDNo:4)
[0045] gyrB-R:5'TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3';(沈QIDNo:5)
[0046]gy巧的PCR扩增反应体系为50yL:10XPCRBuffer(Mg2+)5yL;dNTP Mixture(2. 5mM)5yL;Taq巧U/yL)1yL;gyrB_F(10ymol/L)1yL，gyrB-R(10ymol/L)lyL;HMB27703 基因组DM50ng;d地2〇补足至 50yL。PCR的反应条件为 95°C5min; 95°C30s，55°C45s，72°Clmin，30个循环；72°ClOmin。将扩增产物送交上海生工生 物工程有限公司测序，得HMB27703菌株的gy巧基因序列（见SEQIDNo:6)。将获得 的HMB27703菌株的gy巧基因序列在Genbank中进行同源性比较，同时利用MEGA软件 (MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis,分子进化遗传分析）构建系统发育树。结 果发现HMB27703与枯草芽抱杆菌的gy巧基因序列同源性最高；构建系统发育树（见图 2)，HMB27703菌株与枯草芽抱杆菌聚合到一起，说明HMB27703为枯草芽抱杆菌度acillus subtilis)，并且是一个新菌株。
[0047] 综合W上形态特征、16S rDNA和gy巧基因序列同源性对比分析的结果，可知 HMB27703属于枯草芽抱杆菌度acillus subtilis),并且和现有的枯草芽抱杆菌菌株不同， 是一个新菌株。
[0048] 上述枯草芽抱杆菌HMB27703菌株的鉴定方法，包括W待测菌株的基因组DNA为模 板，W F27和R1492为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:3所示的核 巧酸序列，即为HMB27703菌株。
[0049] 上述枯草芽抱杆菌HMB27703菌株的鉴定方法，包括W待测菌株的基因组DNA为模 板，W gy巧-F和gy巧-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID No: 6所示 的核巧酸序列，即为HMB27703菌株。
[0050] 上述微生物菌剂的鉴定方法，包括W待测菌剂中的基因组DNA为模板，W F27和 R1492为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:3所示的核巧酸序列，即 为HMB27703微生物菌剂。
[0051] 上述微生物菌剂的鉴定方法，包括W待测菌剂中的基因组DNA为模板，Wgy巧-F 和gy巧-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo: 6所示的核巧酸序列， 即为HMB27703微生物菌剂。
[0052]本发明具有的优点和有益效果：（1)本发明为防治棉花立枯病提供了一个高效的 微生物，开辟了一个有效防治途径；(2)本发明枯草芽抱杆菌HMB27703对棉花立枯病的药 效高，平均防效在80. 0 %W上，且针对性强；（3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，环境污染 小；(4)利用本发明防治棉花立枯病持效期长，且不易产生抗药性；（5)本发明制备方法简 单、成本低、使用简单。
【附图说明】 阳化引图1.为根据16SrDNA序列获得的HMB27703菌株的系统发育树图。
[0054] 图2.为根据gy巧基因序列获得的HMB27703菌株的系统发育树图。
【具体实施方式】
[0055] 下面W具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不W任何方式构成对本发明 的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含 量，如无特别说明，均为重量百分含量。
[0056] 实施例1 HMB27703微生物菌剂的制备
[0057] 按照如下步骤进行： 阳化引 （1)菌种活化：将保存于-80°C的菌株HMB27703 (枯草芽抱杆菌菌株HMB27703己 于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为 CGMCCNo. 11458)在LB平板培养基（其组成成分及其重量比为：膜蛋白腺lOg，酵母提取物 5邑，氯化钢5g，琼脂粉15g，水lOOOmL)上在30°C进行活化，挑取单菌落在LB斜面培养基（其 组成成分及其重量比为：膜蛋白腺lOg，酵母提取物5g，氯化钢5g，琼脂粉15g，水lOOOmL) 上在30°C下培养12小时，得活化的菌株；
[0059] (2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基（其组成成分及其重量比为： 膜蛋白腺lOg，酵母提取物5g，氯化钢5g，水lOOOmL)，在250mLS角瓶中装入LB培养液 lOOmU高压湿热灭菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入步骤（1)中一接种环上述活化好的 菌株，在30°C、摇床转速18化pm的条件下进行振荡培养12小时，得种子液；
[0060] (3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1. 5%，黄豆粉2. 0%， 化C1 0. 5%，MnS〇4?&0 0. 6%加入水中，揽拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于 SOOmLS角瓶中，每瓶200mL;在12rC对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降溫到 30°C备用；
[0061] (4)发酵培养：向步骤（3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤（2) 所得种子液2mL;在30°C、摇床转速18化pm条件下进行发酵培养36小时，W后每隔30分钟 从=角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率（芽胞率 (%)=成熟芽胞数/(成熟芽胞数+菌体数）X100);芽胞率达到90%时停止发酵培养；共 发酵培养48小时，得枯草芽抱杆菌HMB27703的液体制剂。
[0062] 实施例2枯草芽抱杆菌HMB27703对棉花立枯菌菌丝生长的抑制作用试验
[0063] (一）试验时间和地点：2013年10月在河北省农林科学院植物保护研究所植物病 害生物防治实验室内进行。
[0064] (二）试验方法： 阳0化](1)供试棉花立枯菌来源：棉花立枯菌RH-2菌株采自河北省耶鄰市邱县棉花立枯 病病株，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物 病理系鉴定为立枯丝核菌烟lizoctoniasolani)，致病力测定表现为强致病力。
[0066] 似平板测定试验：
[0067] 首先将棉花立枯菌RH-2在PDA平板上活化，培养3天后在菌落边缘区域，用打孔 器（0二6mm)打孔制成菌片，将棉花立枯菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例 1步骤（1)中活化的枯草芽抱杆菌HMB27703点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照 (不点接HMB27703菌株的棉花立枯菌生长情况）。25°C恒溫培养，待空白对照即将长满整 个培养皿时，测量棉花立枯菌的对照生长量（菌落半径）和处理生长量（接种HMB27703后 的抑制生长半径），括抗作用用抑菌率表示，计算公式： W側抑菌率（％ )=(对照生长量-处理生长量）/对照生长量X100)。
[0069] 结果（见表1):枯草芽抱杆菌HMB27703对棉花立枯菌的抑制率达87. 18% ;透明 的抑菌带宽10.0毫米；说明枯草芽抱杆菌HMB27703对棉花立枯菌具有明显的抑制作用，具 有防治棉花立枯病的生防潜力。
[0070] 表1HMB27703菌株对棉花立枯菌的括抗作用试验结果
[0071]
[0072] 实施例3枯草芽抱杆菌HMB27703对棉花立枯病的防治效果试验 阳07引（一）试验处理：
[0074] (1)微生物菌剂：实施例1制备的