于第一级拼接序列的5'端的L1具有从5'至3'方向的式II所示的结 构：
[00巧]X0-X1-X2-X3-L1' (II)
[0076] 式中，
[0077] X0为无或任意的长度为1-lOObp核巧酸序列；
[0078] XI为第一重叠区；
[0079] X2为第一限制性内切酶酶切位点；
[0080] X3为无或任意的长度为l-20bp核巧酸序列；
[0081] 11'为待保留的拼接单元序列；
[0082] 其中，X0-X1-X2-X3构成位于5'端的第一侧翼序列；
[0083] 并且，位于第一级拼接序列的3'端的Ln具有从5'至3'方向的式III所示的结 构：
[0084] Ln' -X4-X5-X6-X7 (III)
[0085] 式中，
[0086] X7为无或任意的长度为1-lOObp核巧酸序列；
[0087] X6为第二重叠区；
[008引 X5为第二限制性内切酶酶切位点；
[0089] X4为无或任意的长度为l-20bp核巧酸序列；
[0090] Ln'为待保留的拼接单元序列；
[0091] 其中，X4-X5-X6-X7构成位于3'端的第二侧翼序列；
[0092] 并且，第一重叠区和第二重叠区是互不相同的，且GC含量为0-50% ;
[0093] (ii)所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，
[0094] XOb-X化-X2b-X3b-Z-X4b-X化-X化-X化 （IV)
[0095] 式中，
[0096] X化为X0的互补序列；
[0097] X化为XI的互补序列，即第一重叠区的互补序列；
[009引 X化为所述的第二限制性内切酶酶切位点；
[0099] X3b为X3的互补序列；
[0100] Z为载体的结构序列；
[0101] X4b为X4的互补序列；
[0102] X化为所述第二限制性内切酶酶切位点；；
[0103] X化为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；
[0104] X化为X7的互补序列。
[0105] 在本发明的第H方面，提供了一种用于DNA体外组装的载体，所述载体是线性化 的载体元件，或所述载体经酶切后可形成所述的线性化的载体元件；
[0106] 其中，所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，
[0107]XOb-X化-X2b-X3b-Z-X4b-X化-X化-X化（IV)
[010引 式中，
[0109]X化为X0的互补序列；
[0110]X化为XI的互补序列，即第一重叠区的互补序列；
[0111]X化为所述的第二限制性内切酶酶切位点；
[0112] X3b为X3的互补序列；
[0113]Z为载体的结构序列；
[0114]X4b为X4的互补序列；
[0115]X化为所述第二限制性内切酶酶切位点；；
[011引 X化为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；
[0117]X化为X7的互补序列。
[0118] 在本发明的第四个方面，提供了一种如本发明第二方面所述的的用于DNA体外组 装的构建物或如本发明第H方面所述的用于DNA体外组装的载体的用途，用于高GC含量的 大片段DNA的体外组装。
[0119] 在另一优选例中，所述的高GC含量的大片段DNA包括祀核酸序列，较佳地，所述的 革己核酸序列包括基因簇序列。
[0120] 在另一优选例中，所述的祀核酸序列为放线菌的核巧酸序列。
[0121] 在另一优选例中，所述的高GC含量指GC含量H满足；50%< 90%，较佳地 55%<H《80%。
[0122] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[012引图1显示了改进的Gibson组装方法示意图。其中，在第一级组装（A)中采用PCR将通用重叠区（2化P的A或AG间隔出现）与限制性内切酶酶切位点（NdeI或化eI)引入 到载体或片段中，获得一级组装的出发片段。片段间重叠区长度为30bp;在第二级组装度） 中，分别采用NdeI、NdeI与化el、化el对上一级片段进行酶切，获得第二级组装的出发片段 F1-F3、F4-F6与巧-F9,片段间重叠区长度为45bp。
[0124] 图2显示了改进的Gibson组装方法与原有方法的组装效率对比。从5化至15化， 采用两组片段（F7-F9与F10-F12)进行鉴定。其中：
[0125] 图2A代表原有Gibson组装方法的酶切鉴定结果；
[0126] 图2B代表改进方法的鉴定结果；
[0127] 图2C代表从15化至45化的组装时，改进方法的鉴定结果。每种方法均随机挑选 20个转化子，两次生物学重复。图2C代表阴性对照（空载体pCClBAC的酶切结果），"*"表 示正确组装，Ml与M2分别表示化bDNA梯状条带值NAladder)和A化ndlllDNA梯状条带 值NAladder)。
[012引图3显示了改进方法用于组装原始霉素II生物合成基因簇。
[0129] 图3A显示基因簇体外组装时的等级化拼接模式。
[0130] 图3B显示了最终的原始霉素II生物合成基因簇组装产物四种酶切鉴定结果。
[0131] 图3C显示了组装产物功能互补结果，图示中la与Ila分别表示原始霉素I(PI)与 原始霉素II(PII)的主要成分。肥CB10218表示始旋链霉菌出发菌株（购自上海来益生物药 物研究开发中必），10218APII表示PII生物合成基因簇的缺失菌株、10218APII/BAC-F15 与10218APII/BAC-F1F15分别表示10218APII中导入空载体度AC-F15)与PII生物合成 基因簇体外组装产物度AC-F1F15)的互补菌株。
【具体实施方式】
[0132] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将经典的Gibson等温一步法经 过特殊设计的结构进行适当的改进，可适用于高GC含量DNA片段（来源于Pn生物合成基 因簇）的组装，并设计了实验对此方法的拼接效率等效果进行了验证，在此基础上完成了 本发明。
[0133] 具体而言，本发明人利用建立的DNA组装新方法，其主要为W下2点：
[0134] 1)引入载体与片段间通用的低GC含量的DNA重叠区；2)重叠区两侧设计交错 的限制性内切酶酶切位点W实现等级化组装等策略；将组装效率从原有方法的0提升至 20-30%。
[0135] 实验验证过程：本发明人对来自于始旋链霉菌的PII生物合成基因簇进行了体外 克隆，酶切与全长测序结果显示组装正确；接着，发明人通过对PCR引入的突变进行修复和 功能互补，获得了具有生理功能的PII生物合成基因簇，为后续的代谢工程改造提供了突 破性的改良的拼接技术。
[0136] 术语
[0137] 如本文所用，术语"Gibson等温一步法"是指一种由DanielGibson等人在2009 年建立的一种高效的体外DM组装方法，该方法利用"化ew-back"策略（即体外同源重组 原理），实现了生殖道支原体基因组（大小为580化）的体外合成。
[0138] 如本文所用，术语"始旋链霉菌（Streptomycespristinaespiralis)"是一种在适 当的条件下，可W生产原始霉素（Pristinamycin)的链霉菌。
[0139] Gibson等温一步法
[0140]Gibson等温一步法具体操作步骤如下：
[014。 （1)采用PCR或酶切的方法制备出发片段，采用PCR获得线性载体，同时将重叠区 与限制性内切酶酶切位点引入；
[014引 （2)在15y1Gibson反应体系中加入总体积为5y1等摩尔量的DNA片段（线性 载体用量为50-100ng)，5(TC反应一小时；
[014引做取 1y1 电转 30y1E.coliEPI300 感受态（1mm电击杯，1200V，25yF, 200Q)， 加入ImLS0C复苏两小时，涂板于含有12. 5yg/mL氯霉素的LB固体平板上，37°C培养 16-24h；
[0144] (4)挑单菌接入含有25yg/mL氯霉素的液体LB中，培养至0D600为0. 4-0. 6,加 入1/1000的CopyControl?InductionSolution,继续培养12-1化；
[014引 （5)离必收集菌体，采用.E, 'Z.把A,黎BAC/PACDMKit进行BAC回收。
[0146] 在本发明中，可采用常规的Gibson反应体系和方法。一种典型的Gibson反应体 系和电转感受态高效制备方法如下：
[0147] (1)Gibson反应体系巧00y1)
[014引 財等融巧巧缓巧液 1撕口 1 10 0/ y .1.巧核酸外切酶 0. 32 1 2 U/ U 1 Pk山0 U {)姑帶会酶 10 H 1 撕 0/|1 I Ta<3 ,选梭髓 80 p. .1 d挪游 349. 68 P 1 Total 600 P 1
[0149] (2) 5*等温反应缓冲液化00y1)
[0150] 1 M化is…船1(摊？-巧，3脯P i