用于制备糖和糖浆的方法
【专利说明】用于制备糖和糖浆的方法
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及一种用于产生糖和糖浆（特别是高果糖玉米糖浆（HFCS))的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 已经描述了大量用于将淀粉转化为淀粉水解物（例如麦芽糖、葡萄糖或特制糖 浆）的方法，这些淀粉水解物用作甜味剂或者用作其他糖（例如果糖）的前体。还可以将 葡萄糖发酵为乙醇或其他发酵产品。
[0006] 淀粉是一种由葡萄糖单位链组成的高分子量聚合物。它通常由约80%支链淀粉和 20%直链淀粉组成。支链淀粉是一种分支多糖，其中α -1，4D-葡萄糖残基的直链由α -1，6 糖苷键连接。
[0007] 直链淀粉是一种由D-吡喃葡萄糖单位构成的线性多糖，这些单位通过α -1，4糖 苷键连接在一起。在将淀粉转化为可溶性淀粉水解物的情况下，将淀粉解聚。常规的解聚 方法由一个糊化步骤和两个连续的工艺步骤（即液化过程和糖化过程）组成。颗粒状淀粉 由在室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热一种水性淀粉浆液时，颗粒膨胀并且最后破裂， 将淀粉分子分散至溶液中。在此"糊化"过程中，粘度有显著的增加。由于典型工业方法中 的固体水平为30% -40%，因此不得不稀释或"液化"淀粉以使其能够被操作。如今主要是 通过酶降解而获得粘度的降低。
[0008] HFCS制造自高DX糖浆，术语DX意指按根据糖浆的干物质（DS)计算的右旋糖 (D-葡萄糖）的重量计的百分比。通常用于将淀粉转化为高DX糖浆的整体酶工艺是一个两 阶段过程。第一步是液化，其中长链淀粉被α-淀粉酶降解为较小的分支单位和线性单位 (麦芽糊精）。液化过程典型地是在约105°C -IKTC下进行约5至10分钟，随后在约95°C 下进行约1-2小时。然后将温度降至60°C，添加葡糖淀粉酶或β-淀粉酶和任选地脱支酶 (例如异淀粉酶或普鲁兰酶），并且将糖化过程进行约24至72小时。
[0009] WO 2013/057141和WO 2013/057143描述了 α -淀粉酶变体及其在例如淀粉加工、 发酵产品产生、用于由包含未糊化淀粉的材料产生发酵产品的方法以及用于由包含糊化淀 粉的材料产生发酵产品的方法中的用途。这些变体被描述为当在低PH下和/或高温下，特 别是在低钙浓度下，并且特别是在至少〇. 1%淀粉的存在下（例如，在〇. 9%或1%淀粉的存 在下）孵育时具有例如增加的稳定性。
[0010] 仍需要对用于产生糖和糖浆的方法进行改进。
[0011] 发明概述
[0012] 在一方面，本发明提供了一种用于产生糖浆的方法：
[0013] a)用α -淀粉酶变体液化水性颗粒状淀粉浆液，该变体在对应于SEQ ID NO: 1的 以下任何位置的一个或多个位置处包括改变：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、 185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437 以及 450,以提供包含液化淀粉的材料；
[0014] b)在葡糖淀粉酶和来源于脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans)、枯草芽孢杆 菌、淀粉脱支芽孢杆菌（Bacillus amyloderamificans)或嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰 酶的存在下糖化该包含液化淀粉的材料，以提供右旋糖糖浆，并且任选地
[0015] c)进行异构化以提供果糖糖浆。
[0016] 在一些方面，α -淀粉酶变体、葡糖淀粉酶和来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶的组 合对观察的最终糖浆产生增强效果，特别是与没有组合酶情况下获得的DX百分比相比，DX 有所增加。
[0017] 附图简要说明
[0018] 图1示出具有以下氨基酸序列的α -淀粉酶的比对：
[0019] SEQ ID NO: 1是地衣芽孢杆菌α -淀粉酶。
[0020] SEQ ID NO: 2是嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶。
[0021] SEQ ID Ν0:3 是在应用微生物学杂志（J. Appl. Microbiology)，1997， 82:325-334 (SWALL:q59222)中描述的芽孢杆菌属α-淀粉酶TS-23。
[0022] SEQ ID Ν0:4是在TO 2005/001064中描述的黄热芽孢杆菌（Bacillus flavothermus) α -淀粉酶 AMY1048。
[0023] SEQ ID NO: 5是在TO 04/113511中描述为SEQ ID NO: 21的芽孢杆菌属α-淀粉 酶 TS-22〇
[0024] SEQ ID NO:6是解淀粉芽孢杆菌α -淀粉酶。
[0025] SEQ ID NO: 7是在WO 95/26397中描述为SEQ ID NO 1的芽孢杆菌碱性属SP690 淀粉酶。
[0026] SEQ ID NO:8是在TO 95/26397 中描述为 SEQ ID NO 2 的盐敏芽孢杆菌（Bacillus halmapalus) α -淀粉酶。
[0027] SEQ ID NO:9是在WO 00/60060中描述为SEQ ID NO 4的芽孢杆菌碱性属ΑΑ560 淀粉酶。
[0028] SEQ ID NO: 10是在WO 200210356中描述为SEQ ID NO 2的芽孢杆菌碱性属A 7-7 淀粉酶。
[0029] SEQ ID NO: 11是在冢本（Tsukamoto)等人（1988,生物化学与生物物理研究通讯 (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) 151:25-33)中描述的芽抱杆菌喊性属 SP707 淀粉酶。
[0030] SEQ ID NO: 12是在EP 1022334中描述为SEQ ID NO 2的芽孢杆菌碱性属K-38淀 粉酶。
[0031] SEQ ID NO: 13 是在李（Lee)等人，2006，生物化学杂志（J. Biochem)， 139:997-1005中描述的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。
[0032] SEQ ID NO: 14是以前在例如WO 2002/010355中披露的变体α -淀粉酶LE399。
[0033] 发明详细说明
[0034] 定义
[0035] 术语"颗粒状淀粉"被理解为生的未煮过的淀粉，即尚未经历糊化的淀粉。淀粉是 在植物体内作为不溶于水的微小颗粒而形成。这些颗粒在低于初始糊化温度的温度下被保 存为淀粉。当放入冷水中时，这些颗粒可以吸收少量的液体。高达50°C至70°C，膨胀是可 逆的，可逆性程度取决于具体的淀粉。在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为"糊化"。
[0036] 术语"特制糖浆"是本领域公认的术语并且根据"右旋糖当量"（DE)和碳水化 合物谱进行表征（参见由G. G.伯奇（G. G. Birch)和L. F.格林（L. F. Green)编辑的教科 书"食品碳水化合物的分子结构与功能（Molecular Structure and Function of Food Carbohydrate)"中的第50+页的文章"新特制葡萄糖糖衆（New Speciality Glucose Syrups)"，应用科学出版社有限公司（Applied Science Publishers LTD.)，伦敦）。典型 地，特制糖浆的DE范围是从35至45。
[0037] α -淀粉酶：α -淀粉酶（E. C. 3. 2. I. 1)是催化淀粉以及其他线性和分支1，4糖苷 寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可根据 在实例中描述的程序例如通过PNP-G7测定来确定。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO: 1的成熟多肽的α -淀粉酶活性的至少20 %，例如至少40 %、至少50 %、至少60 %、至 少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%。在另一方面，本申请的变体具有其 亲本的α -淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%、至少95%或至少100%。
[0038] 葡糖淀粉酶：葡糖淀粉酶是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还 原端释放的l，4-a_D-葡聚糖葡糖水解酶（EC 3.2. 1.3)。出于本发明的目的，根据下文的 "材料与方法"部分所述的程序来确定葡糖淀粉酶活性。Novo葡糖淀粉酶单位（AGU)定义为 在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37°C，pH 4. 3,底物：麦芽糖23. 2mM， 缓冲液：乙酸盐0. 1M，反应时间5分钟。
[0039] 片段：术语"片段"意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个（例 如，若干个）氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一个片段含有至 少300个氨基酸残基、至少350个氨基酸残基、至少400个氨基酸残基、至少450个氨基酸 残基、至少470个氨基酸残基或至少480个氨基酸残基。
[0040] 分离的：术语"分离的"意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的 物质的非限制性实例包括（1)任何非天然发生的物质，（2)包括但不限于任何酶、变体、核 酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质上相关的一种或多种或 所有天然存在的成分中去除；（3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或（4) 通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质（例如，编码该物 质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质上相关的启动子强的启动子）。一种分 离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0041] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以 产生由相同的多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽（即，具有不同的C-末端和/或 N-末端氨基酸）的混合物。成熟形式的一些α -淀粉酶（例如，一些细菌α -淀粉酶）包 括含有用于底物水解的活性位点的催化结构域以及用于结合碳水化合物底物（淀粉）的一 个或多个碳水化合物结合模块（CBM)以及任选地将一个或多个CBM与催化结构域连接的多 肽，后一类型的区域通常称为"接头"。
[0042] 亲本或亲本α-淀粉酶：术语"亲本"或"亲本α-淀粉酶"意指进行变化以产生 本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的（野生型）多肽或其变体或片段。
[0043] 普鲁兰酶：普鲁兰酶（EC 3.2. 1.41)水解普鲁兰（α-1,6-连接的麦芽三糖单 位的线性聚合物）中和支链淀粉和糖原以及支链淀粉和糖原的α-和β-极限糊精中 的a-l，6_D-糖苷键。普鲁兰酶（pullulanase)的一个或多个其他名称是例如淀粉普鲁 兰酶（amylopullulanase)，支链淀粉6-葡聚糖水解酶；细菌脱支酶；脱支酶；α -糊精内 切-1，6-α -葡糖苷酶；R-酶。系统名称是"普鲁兰α -1，6-葡聚糖水解酶"。属于此类别 的酶可以包括碳水化合物结合模块（CBM)。
[0044] 碳水化合物结合模块：碳水化合物结合模块或碳水化合物结合结构域是能够通 常以非共价结合而结合碳水化合物的蛋白质结构。碳水化合物结合结构域包括结合多糖 (例如纤维素、木聚糖或淀粉）的结构域。若干碳水化合物结合结构域已经被描述于文献 中，并且已经被分组为多个家族，综述参见布拉司顿（Boraston)等人（2004)生物化学杂志 (Biochem. J.) 382:769-781 和 http: //afmb. cnrs-mrs. fr/CAZY/index. html 中对 CBM 家族 的分组。"淀粉结合结构域"是对淀粉（特别是生淀粉）具有特异性的碳水化合物结合结 构域。淀粉结合结构域至少被发现于碳水化合物结合结构域家族CBM-20、CBM-21、CBM-25、 CBM-26、CBM-34、CBM-41 以及 CBM-45 中。
[0045] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数"序 列一致性"来描述。
[0046] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件 套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人， 2000,遗传学趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔 (Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德尔 曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物学杂志（J. Mol. Biol.) 48:443-453)来确定两个氨 基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0047] (一致的残基XIOOV (比对长度-比对中的空位总数）
[0048] 变体：术语"变体"意指在一个或多个（例如，若干个）位置处包括改变（即，取代、 插入和/或缺失）的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一 个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于占据一个位 置的氨基酸添加一个或多个（例如，若干个）氨基酸（例如，1-5个氨基酸）。在一方面，本 发明的变体具有SEQ ID NO: 1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%。在另一方 面，本申请的变体具有其亲本的α -淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至 少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少100 %。α -淀粉酶活性可通过 在实例中描述的PNP-G7测定来确定。
[0049] 野生型α -淀粉酶：术语"野生型" α -淀粉酶意指由天然存在的微生物，如在自然 界中发现的细菌、酵母或丝状真菌来表达的α-淀粉酶。
[0050] 变体命名惯例：出于本发明的目的，将SEQ ID NO: 1中披露的成熟多肽用来确定另 一种α-淀粉酶中的对应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1 中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物 学开放软件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice) 等人，2000,遗传学趋势（Trends Genet. ) 16:276-277)(优选5. 0.0版或更新版本）的尼德 尔（Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman (尼德 尔曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物学杂志（J. Mol. Biol. )48:443-453)来确定对应 于SEQ ID NO: 1中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。所使用的参数 是空位开放罚分10,空位延伸罚分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 阵。
[0051] 可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在 另一种α -淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE (通 过对数预期的多种序列比较；版本3. 5或更新版本；埃德加（Edgar)，2004，核酸研究 (Nucleic Acids Research) 32:1792-I797)、MAFFT (版本 6· 857 或更新版本；加藤（Katoh) 和库马（Kuma)，2002,核酸研究30:3059-3066 ;加藤等人，2005,核酸研究33:511-518 ; 加藤和都（Toh)，2007,生物信息学（Bioinformatics) 23:372-374 ;加藤等人，2009,分子 生物学方法（Methods in Molecular Biology)537:39-64;加藤和都，2010,生物信息学 26:1899-1900)以及采用Clustaiwa 83或更新版本；汤姆斯（Thompson)等人，1994,核酸 研究 22:4673-4680)的 EMBOSS EMMA。
[0052] 当其他酶与SEQ ID N0:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法 不能检测其相互关系时（林达尔（Lindahl)和埃洛弗松（Elofsson)，2000,分子生物学 杂志（J. Mol. Biol.) 295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索 中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示（谱 (profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个 谱，并且能够检测远距离同源物（阿特休尔（Atschul)等人，1997,核酸研究（Nucleic Acids Res. )25:33