基因单核巧酸多态性位点特异引物分别与军团菌属 特异引物配对扩增26化P内的一段序列；化261F- (LPA628R)引物对扩增片段为203bp; (LP-C6叩）-GL261R引物对扩增序列为97bp。
[0026] 表2引物的配对及其扩增片段大小
其中： (1) 化261F与化261R引物扩增的核巧酸序列为：
(2) 化26IF与LP-A628R引物扩增的核巧酸序列为：
(3)LP-C629F与化26IR引物扩增的核巧酸序列为：
[0027] 实施例3、军团菌快速检测与分型的方法 1) 应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA:选取标本进行预处 理，再使用细菌基因组DNA提取液提取细菌基因组DNA，其中，所述DNA提取液的成分如下：
2)W细菌基因组DNA为模板，采用实施例1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物进行PCR扩增；所述的PCR反应混合液由W下组分 组成：2XPCR反应混合液UXEasyhqPCRSuperMix,含 0.1UTaqPolymerase/Pl, 500 剛dNTP，20mlTris-肥 1 (抑8. 3)，100mlKC1，3mlMgClz) 12. 5yL，（1地2〇 5. 5yL。 [002引 3 )将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增； 4)将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像结果，阳性对照应该有对照的S条条带分别为26化P，203bp和97bp，而阴性对照则无上述=条条带出现。若凝胶成像后， 阴性对照出现26化P条带，或/和阳性对照未出现26化P，203bp和97bp电泳条带，则试验 结果不可信，可能存在污染或操作有误。试验管的产物经过电泳若出现26化P条带，则说明 标本中检出了军团菌，若无261bp条带出现，则标本中未检出军团菌，即标本中不存在军团 菌；而试验管中除了 26化P条带还同时出现另外两条条带即203bp和97bp条带，则说明检 出的军团菌为嗜肺军团菌；若仅出现261bp条带或除了 261bp条带仅有一条203bp或97bp 条带出现，则检出的军团菌为非嗜肺军团菌。
[0029] 实施例4、疲标本的军团菌检测 1、含有嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌的疲标本处理： 1)在1.5ml离屯、管中加入0.5ml军团菌专用的疲消化液；疲消化液为自制，其具体 组成为： 二硫苏糖醇（DTT)O. 2g，乙二胺四乙酸0.894g，氯化钟0.04g，憐酸氨二钟0.36g和 憐酸二氨钟0.04g，加双蒸水混匀后定容为10ml。
[0030] 2)用枪头或灭菌牙签从疲标本中吸取或挑取约0. 5 ml疲标本，置于上述疲消化液 中； 3) 充分混匀后，37°C水浴10~15min; 4) 在13000rpm的离屯、机中离屯、5分钟后，弃上清，用0. 5ml无菌水洗涂2次后离屯、 留沉淀。
[0031] 2.标本中细菌基因组DNA的提取：在上述留取沉淀的离屯、管中加入细菌基因组 DNA提取液100yl，在56°C水浴30min,接着在100°C水浴10min,离屯、沉淀，在5000巧m下离屯、5min,上清液即为提取到的基因组DNA，供作DNA模版。
[0032] 3.PCR反应 1)每个标本准备3个PCR管，每管中分别加入两种引物混合液3y1，标记好管的编号。 阳性对照及阴性对照亦各为一管，编号为PC或NC，直接加入5y1双蒸水进行反应；阳性对 照液与阴性对照液的组成参见表3。
[0033] 表3阳性对照液和阴性对照液的组成配方
PCR反应条件为：94°C3min, 94°C20S,59°C20S,72°C25s，35 个循环，72°C5min, 4°C保溫。
[0034] 4.琼脂糖凝胶电泳 反应完成后，将产物琼脂糖凝胶电泳，取5yIPCR产物和5yIDNAMarker，加入I. 5% 琼脂糖凝胶中电泳40min,DNAMarker的条带从小到大分别为10化P，20化P，30化P，40化P， SOObp和 600bp。
[00对5.试验结果： 试验结果如图1所示，其中，Marker条带；从下到上分别为：100bp、200bp、300bp、 400bp、500bp和600bp，1-4分别为各个不同的菌种鉴定结果，PC为阳性对照，NC为阴性对 照。！道出现了 26化p、203bp和97bp条带，说明检出的军团菌为嗜肺军团菌；2道仅出现 26化P条带，3道出现26化P和203bp条带，4道出现26化P和97bp条带，说明2-4道检出的 军团菌为非嗜肺军团菌。本发明的军团菌快速检测与分型的方法的检测结果与实际的结果 一致，证明本发明提供的军团菌快速检测与分型的方法具有良好的实用性。
【主权项】
1. 一种军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，包括细菌基因组DNA提取液、PCR 反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液，所述PCR引物混合液、阳性对照液和 阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异 引物，所述军团菌属特异引物为： GL261F:5' -GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3'， GL261R:5' -CGATCTCTACGCATTTCACCG-3' ； 所述嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为： LP-A628R:5' -GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3'， LP-C629F :5' - CTGGGCTTAACCTGGGAC-3'。2. 如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述军团菌属特 异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的靶基因为16srRNA基 因。3. 如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述细菌基因组 DNA提取液的配方为：Chelex100resin5%Jris-HCl10mM，pH8. 3;乙二胺四乙酸二钠 0? I mM;叠氮钠 0? 1 %;蛋白酶 K 200 μg/ml。4. 如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为 2 XPCR反应液，所述2XPCR反应液的组分及其组分浓度为： 0? IU/>1 EasyTaq DNA 聚合酶；500 剛 dNTP ;20 mM Tris-HCl，pH8. 3 ;100 mM KCl ; 3 mM MgCl2。5. 如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述PCR引物混合 液中军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度 比为 1_3 :1_3。6. 如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液 还含有嗜肺军团菌基因组DNA，所述军团菌基因组DNA核苷酸序列在NCBI基因库上编号为 NR_074231〇7. -种军团菌快速检测与分型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： Sl应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA; S2以细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌 16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物进行PCR扩增； S3将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增； S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。8. 如权利要求7所述的军团菌快速检测与分型的检测方法，其特征在于，所述步骤S2 中的PCR扩增反应条件包括：阶段1:94°C3min;阶段2:94°C20s;阶段3:59°C20s;阶段 4 :72°C25s;35 个循环；阶段 5 :72°C5min;在 4°C保温。9. 如权利要求8所述的军团菌快速检测与分型的检测方法，其特征在于，所述步骤S2 中军团菌属特异引物扩增序列为261bp。10. 如权利要求8所述的军团菌快速检测与分型的检测方法，其特征在于，所述步骤S2 中肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物分别与军团菌属特异引物配对扩 增 261bp 内的一段序列；GL261F- (LPA628R)引物对扩增片段为 203bp ;(LP-C629F)-GL261R 引物对扩增序列为97bp。
【专利摘要】本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法。本发明提供的军团菌快速检测与分型试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液,所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s？rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物。本发明提供的试剂盒具有特异性强和准确性高的优点，该试剂盒可以一步快速检测出是否含有军团菌，同时还可以鉴别出军团菌是嗜肺军团菌还是非嗜肺军团菌，无需进行多次凝胶电泳分析，节省成本，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的军团菌快速检测与分型的试剂盒。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105219847
【申请号】CN201510529989
【发明人】朱庆义, 詹晓勇, 胡朝晖, 梁耀铭
【申请人】广州金域医学检验中心有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年8月26日