的乙酷氧基 (5C170. 2,170. 1)的相关性，表明C-I( 5C74. 7)和C-7 ( 5C74. 0)位分别连有一个乙酷氧 基。此外，两个含氧碳信号[5C79. 6 (C，5-C)和53. 7 (CH，6-C)]和氨质子信号[5册.74 (山 J= 8. 7Hz，H-6)]的相关性表明该化合物含有一个5, 6-环氧基团。在R犯SY谱中，H-I与 Me-20,Me-20 与H-8,H-8 与H-6W及H-6 与Me-19 的相关性表明H-1，H-6,H-8,H-19 和 H-20为0型构型，而H-9与H-7的交叉峰显示运些质子的a构型。综合氨谱、碳谱、HMBC 谱和R犯SY谱，W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构 型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[002引实施例2:化合物（I)药理作用试验[0027] 一、材料和仪器
[002引PC12细胞株，安徽中医学院实验中屯、赠与。AP14。蛋白购于Sigma公司。化合物 (I)为自制，HPLC归一化纯度大于98%dDMEM/F12培养基（进口分装购于北京赛默飞世尔 生物化学制品有限公司。NewbomCalfSerum购于BeijingSolarbioScience&Technology Co.，Ltd。MTT购于美国Amresco公司。凯基AnnexinV-FITC细胞调亡检测试剂盒购于南 京凯基生物技术有限公司。多聚甲醒购于中国医药集团化学试剂有限公司。Bcl-2多克隆 抗体购于武汉博±德生物技术有限公司。Bax多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公 司。切t-c多克隆抗体购于武汉博±德生物技术有限公司。羊抗兔IgG/FITC购于北京博 奥森生物技术有限公司。羊抗鼠IgG/化+L)购于江苏碧云天生物公司。正常山羊血清购于 武汉博±德生物技术有限公司。SABC免疫组化试剂盒购于武汉博±德生物工程有限公司。 DAB显色试剂盒购于武汉博±德生物技术有限公司。
[0029] 电子分析天平（FA2004型，上海雷磁精密科学仪器公司），水浴锅（皿?SI1-4型， 北京医疗器械厂），酶标仪巧Lx-800型，美国Bio-Tek)，流式细胞仪巧PIC化-MCL型，美 国BeckmanCouiter公司），高速冷冻离屯、机（3K30型，美国Sigma公司，二氧化碳培养箱 (C0-150型，美国NBS有限公司），OLYMPUS巧光显微镜度X41型，带DP70摄像系统，日本 Olympus公司产品）。
[0030] 二、试验方法
[003U 1、AP14。解育
[003引A014。用去离子水配制成1000ymol/L储存液并分装，放置于冰箱-20°C储存，临 用用前一周取出在37°C培养箱解育7d，使之聚集老化。
[003引 2、细胞的培养
[0034] ?(：12细胞株用含10%胎牛血清、10011/而青霉素、1001]/1111^链霉素的0161/。12培 养基在玻璃培养瓶中培养，C〇2细胞培养箱的培养条件为37°C，5%CO2浓度，饱和湿度，待细 胞长至80 %丰度后用0. 25 %的膜酶消化传代1次（约2-3d)，倒置显微镜观察细胞生长状 况，实验时取对数生长期细胞进行实验。进行MlT实验前将细胞接种到96孔培养板用无血 清培养基培养；流式细胞仪检测前将细胞接种至6孔培养板用无血清培养既培养；免疫组 化实验均用24孔培养板爬片法培养细胞，培养基为无血清培养基。
[0035] 3、细胞给药处理及分组
[0036] 细胞共分为五组，无血清培养基接种24h后进行药物干预：①正常对照组：正常 PC。细胞；②模型组：25ymol/LA014。;③化合物（I)低剂量组：2日ymol/LA014。巧Omg/ 1化合物（1)屈化合物（1)中剂量组：25減〇1/1^\014。+1〇〇111旨/1化合物（1);(1)化 合物（I)高剂量组：25iimol/LA0i4。巧OOmg/L化合物（I)。药物处理24h后进行检测 各项指标。
[0037] 4、MlT检测各组细胞活力
[003引取对数生长期的细胞，膜酶消化后W 1 X IO5个/血的细胞密度，每孔100 y L接种 于96孔板中无血清培养2地，然后按照上述分组方法进行药物干预，每组设置6个复孔，24h 后，每孔加入5mg/mL的MT溶液20 y L继续在C02细胞培养箱中解育4h，然后取出96孔培 养板，弃去上清液，每孔加入150 y L的DMS0,放在摇床上振荡lOmin，待紫色结晶完全溶解 后用酶标仪在490nm波长处检测各孔的吸光值。W只加培养液的孔为调零参照，细胞活力 用百分比表达，视对照组的细胞活性为100%。结果计算：细胞存活率=(实验组OD值-空 白对照组OD值）/(对照组OD值-空白对照组OD值）X100 %。
[00測 5、统计分析
[0040] 采用SPSS17. 0分析软件对统计结果进行处理，数据采用单因素方差分析，用均数 ±标准差（占:S)表示，组间采用LSD比较，P<0. 05为具有显著性差异，P<0.Ol为极其显著 性差异，图表由Excel2003绘制。
[0041]S、结果及结论
[0042] MlT测试结果显示，与正常组细胞比较，模型组细胞活性明显降低（P<0. 01)， 化合物（I)干预后细胞活性有所提高，其中高、中剂量组细胞活性的升高具有统计学 意义（P<0. 01，P<0. 05)，低剂量组细胞活性改变不大（P〉0. 05)。见表1(与模型组比较 冲<0. 05, *冲<0. 01)。
[004引结论，本研究证实AP1 4。的毒性损害神经细胞，引起PC12大量调亡，细胞活性下 降，化合物（I)干预后调亡情况得到改善。
[0044]表1MTT法化合物（I)对A0 1 4。诱导PC12细胞活性的影响（品8;，n= 6)
[004引实施例3
[0047] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1: 7 的比例加入赋形剂，制粒压片。
[004引实施例4
[0049] 口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。
[0050] 实施例5
[0051] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒 石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[00閲实施例6
[0053] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0054] 实施例7
[00巧]无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，将其溶于无菌注射用 水中，揽拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安飯中，低溫冷冻干燥后无菌烙 封得粉针剂。
[0056] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I):2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将 猫爪草的干燥块根粉碎，用70~80 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用 石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁 醇萃取物；(b)步骤（a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再 用70 %乙醇洗脱8个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩得70 %乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤 (b)中70 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、50:1、25:1、10:1和1:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d) 中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度 洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，用75% 乙醇热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为D101 型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备神经保护的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备神经保护的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于神经保护的新的二萜化合物，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜类化合物，可以从猫爪草的干燥块根中提取、分离纯化得到。体外试验证实Aβ1-40的毒性损害神经细胞，引起PC12大量凋亡，细胞活性下降，该化合物干预后凋亡情况得到改善，提高细胞的活性，可以用来开发成神经保护的药物。
【IPC分类】A61P25/00, C07D407/06, A61K31/341
【公开号】CN105294665
【申请号】CN201510863460
【发明人】吕涛
【申请人】吕涛
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月1日