+母液为硝酸银溶液，Cd 2+母液为氯化镉溶液，Co 2+母液为氯化钴溶液，Cu 2+母液为硝酸铜溶液，Zn2+母液为硝酸铅溶液，Mg 2+母液为硝酸镁溶液，Ca2+母液为硝酸钙溶液。
[0082]3.将1-12号反应后的溶液分别通入17PS探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器进行检测17PS探针芯片对不同金属离子的选择性，收集0-900S时间范围内荧光信号，并进行结果分析，利用最强荧光信号强度计算信号强度比率。信号强度比率(％)=(待测金属离子的最强焚光信号强度/10 μ M Pb2+的最强焚光信号强度)X 100%。
[0083]4、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2% (质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的17PS探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH = 7.4)再生芯片。
[0084]结果如图3所示，发现11种金属离子相对于Pb2+的信号强度比率均小于10%，干扰性可以忽略，该探针芯片对于Pb2+检测具有良好的选择性。
[0085]实施例3、浓度为10 μ Μ的铅离子(Pb2+)溶液的重复性检测
[0086]一、制备17PS探针芯片
[0087]制备方法同实施例1。
[0088]二、17PS探针芯片的应用
[0089]用于本实施例的全光纤倏逝波生物传感器见中国专利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
[0090]含有17EB-17SF的杂交液的制备方法同实施例1。
[0091]检测步骤:
[0092]1、将步骤一制备的17PS探针芯片装入全光纤倏逝波生物传感器中。
[0093]2、将浓度为10 μ Μ的铅离子(Pb2+)溶液加入到含有300 μ L的含有17EB-17SF的杂交液的试管中，其中浓度为10 μ Μ的铅离子(Pb2+)溶液的加入体积彡1%的含有17EB-17SF的杂交液的体积，室温(20-30°C)静置8min进行反应，得到反应后的溶液，对照为加入等体积的蒸馏水替代浓度为10 μ Μ的铅离子(Pb2+)溶液。
[0094]3.将反应后的溶液的通入17PS探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器进行17PS探针芯片对于铅离子(Pb2+)的检测，收集0-900s时间范围内荧光信号。
[0095]4、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2% (质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的17PS探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH = 7.4)再生芯片，完成第1次检测。
[0096]5、重复步骤1-4，共重复14次，完成第2_15次检测。
[0097]利用最强荧光信号强度计算信号强度比率。信号强度比率)=(单次信号强度/信号强度的平均值)X100%。
[0098]结果如图4所示，17PS探针芯片对于铅离子(Pb2+)检测具有很好的重复性。按上述检测步骤，对于浓度为10 μΜ的Pb2+进行15次检测的实验分析结果表明，数据具有良好的一致性，该探针芯片重复性好。
[0099]实施例4、饮用水中铅离子(Pb2+)的检测
[0100]一、制备17PS探针芯片
[0101]制备方法同实施例1。
[0102]二、17PS探针芯片的应用
[0103]用于本实施例的全光纤倏逝波生物传感器见中国专利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
[0104]含有17EB-17SF的的杂交液的制备方法同实施例1。
[0105]含铅离子(Pb2+)饮用水的配制:取丹江口水库水，将其过0.22 μπι的过滤膜，得到过滤水；在lOOOmL过滤水加入浓度为1M的圆03溶液调节pH至1，得到ΗΝ0 3酸化水样，将浓度为1000mg/L的铅离子(Pb2+)标准溶液(采用浓度为0.1M的硝酸溶液配制的铅离子(Pb2+)标准溶液)加入到ΗΝ03酸化水样中，配置成铅离子(Pb2+)浓度梯度分别为ΟμΜ的ΗΝ03酸化水样，1.67 μ Μ的ΗΝ0 3酸化水样，3.34 μ Μ的ΗΝ0 3酸化水样，6.67 μ Μ的ΗΝ0 3酸化水样和10 μ Μ的ΗΝ03酸化水样。
[0106]检测步骤:
[0107]1、将步骤一制备的17PS探针芯片装入全光纤倏逝波生物传感器中。
[0108]2、分别向1-5号试管中各加入300 yL的含有17EB-17SF的杂交液，将含不同浓度铅离子(Pb2+)的ΗΝ03酸化水样依次加入到1-5号含有300 μ L的含有17EB-17SF的杂交液的试管中，其中含不同浓度铅离子(Pb2+)的HNOJI化水样的加入体积均相同且< 1%的含有17EB-17SF的杂交液的体积，室温(20-30°C )静置8min进行反应，分别得到1_5号反应后的溶液。
[0109]3、将1-5号反应后的溶液分别通入17PS探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器检测含不同浓度铅离子(Pb2+)的ΗΝ03酸化水样中铅离子(Pb2+)的浓度，收集0-900s时间范围内荧光信号，利用最强荧光信号强度进行结果分析。
[0110]4、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2% (质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的17PS探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH = 7.4)再生芯片。
[0111]结果如图5所示，将浓度为0、1.67、3.34、6.67和10.0 μ Μ的Pb2+检测的最强荧光信号强度作为纵坐标，Pb2+浓度值作为横坐标拟合得到趋势线:
[0112]y = 44.02x+82.21，R2= 0.98，具有很好的线性关系，表明该方法适用于实际水样检测。
【主权项】
1.一种铅离子的检测方法，其特征在于:所述方法利用Pb2+诱导脱氧核酶催化与其互补的底物链发生断裂的原理，在20-30°C使含有Pb2+的待测样品中的Pb 2+诱导名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶催化与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸发生断裂，得到名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度； 所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。2.一种铅离子的检测方法，其特征在于:所述方法包括: 1)制备含有17EB-17SF的杂交液；所述17EB-17SF是由名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶和与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸制成的双链DNA，所述杂交液中不含游离状态的所述17SF ; 2)在20-30°C，将待测样品与所述含有17EB-17SF的杂交液混合，在Pb2+诱导下，所述17EB催化所述17SF发生断裂，得到含有名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段的反应液，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度； 所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述含有17EB-17SF的杂交液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为PH7.2-7.4，浓度为10-50mM的Tris-HAc缓冲液；所述溶质为所述17EB-17SF和NaN03，所述17EB-17SF在所述含有17EB-17SF的杂交液中的浓度为20_50nM，NaN03在所述含有17EB-17SF的杂交液中的浓度为30_300mM。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述脱氧核酶为8-17DNAzyme。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述荧光淬灭基团在所述17EB中的位置和所述荧光基团在所述17SF中的位置满足所述17EB与所述17SF能形成所述17EB-17SFo6.根据权利要求1-5中任一所述方法，其特征在于:所述荧光基团为羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3、花青素荧光染料Cy5和花青素荧光染料Cy5.5中任一种；所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ1，荧光淬灭基团Dabcyl、荧光淬灭基团BHQ2和荧光淬灭基团BHQ3中任一种。7.根据权利要求1-6中任一所述方法，其特征在于:所述铅离子的检测方法中，所述待测样品为环境样品。8.根据权利要求1-7中任一所述方法，其特征在于:所述荧光强度通过倏逝波检测仪器进行检测。9.权利要求1-8中任一所述方法在检测环境样品中铅离子含量中的应用。
【专利摘要】本发明公开了基于8-17？DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用。在Pb2+作用下，8-17？DNAzyme可以催化断裂其互补底物链，利用固定在芯片表面的探针捕获断裂后释放到溶液中的带荧光标记的部分底物链，借助于倏逝波激发捕获的底物链，建立荧光信号与Pb2+浓度的关系。本发明的检测方法可在室温(20-30℃)20分钟完成Pb2+的检测，对Pb2+的最低检测限为20nM。本发明的检测方法可在室温能够快速、准确地进行饮用水中铅离子(Pb2+)的检测，而且特异性强，不受其它金属离子的干扰，重复性好。本发明的检测方法具有特异性强、性能稳定、易于再生、检测成本低、并能与仪器结合的优势。
【IPC分类】C12Q1/44, C12Q1/68
【公开号】CN105296598
【申请号】CN201510895100
【发明人】何苗, 韩世同, 施汉昌, 周小红, 汪用志
【申请人】清华大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月8日