一种四齿β二酮配体-铕荧光配合物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种四齿P二酮配体-铕(III)荧光配合物及制备和应用。
【背景技术】
[0002] 稀土离子(包括Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+)与配位体形成的荧光配合物具有许多特殊的 性质：（1)荧光寿命非常长，通常在IOOUs以上，这是由于稀土配合物的发光是经过配体三 重态的能量转移所致；（2)荧光发光的Stokes位移非常大，大部分在250nm以上；（3)稀土 离子的荧光发光的特征峰非常尖锐，半峰宽通常在l〇_15nm。这些性质为其在时间分辨荧 光免疫分析、时间分辨荧光核酸杂交分析和时间分辨荧光生物成像等方面的应用提供了前 提。
[0003] 在时间分辨荧光分析与成像方面，最关键的一步就是对各种生物分子如抗体、抗 原、蛋白质和核酸等用稀土离子荧光配合物进行标记。到目前为止，可用于生物分子荧 光标记的稀土配合物荧光探针主要包括三价铕离子与3-二酮类配位体形成的荧光配 合物及三价铕离子与芳香胺类配位体形成的荧光配合物。（文献1:1 .Hemmila，v.-M. Mukkala,Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.，2001，38, 441;文献 2 :J.Yuan,G.Wang,TrendsAnal. Chem.，2006, 25, 490)。相对于三价稀土的芳香胺类配合物荧光标记探针来说，三价铕离子 的@ -二酮类配合物发光效率更高，合成更简单，成本更低廉，故这类荧光探针在时间分辨 分析和成像方面的应用具有较高的实用意义。
[0004] 基于上述原因，近年来合成了许多氯磺酰基化四齿(6-二酮类配位体：包括 4,4' -二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-七氟-4"，6"-己二酮-6"-基）氯磺酰基-邻二 苯基苯（简称BHHCT，文献 3J.Yuan,K.Matsumoto,H.Kimura,Anal.Chem.，1998, 70, 596); 4,4'-二（1"，1"，1"，2"，2"-五氟-3"，5"-戊二酮-5"-基）氯磺酰基-邻二苯基苯 (简称BPPCT，文献 4 :R.Connally,D.Veal,J.Piper,FEMSMicrobiol.Ecol.，2002, 41，239); 4,4' -biS(r'，r'，r'-三氟-2"，4"-丁二酮-4"-基）氯磺酰基-邻二苯基苯(简 称BTBCB，文献 5:F.B.Wu，C.Zhang，Anal.Biochem.，2002,311，57);l，10-二（4，，-氯 磺酰基-1'，1"_联苯-4' -基）-4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7-八氟癸烷-1，3, 8, 10-四酮(简称 BCD0T，文献 6J.Yuan,K.Matsumoto,Anal.Sci.，1996, 12,695) ;1，10-二（8,-氯磺酰 基-二苯并噻吩-2' _基）4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7-八氟癸烷-1，3, 8, 10-四酮(简称BC0T，文 献 7 :J.Yuan,K.Matsumoto,J.Pharm.Biomed.Anal. ,1997, 15, 1397) ;1，10-二（5'_ 氯 磺酰基-噻吩-2' -基）_4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7-八氟癸烷-1，3, 8, 10-四酮（简称BCT0T， 文献 8 :F.Wu,S.Han,C.Zhang,Y.F.He,Anal.Chem.，2002, 74, 5882)，以及最新的 1，2-二 (1"，1"，1"，2"，2"，3"，3" -七氟-4"，6"-己二酮-6" -基-对苄基）-4-氯磺酰基 苯（简称BHHBCB，文献 9 :L.Zhang,Y.J.Wang,Z.Q.Ye,D.Y.Jin,J.L.Yuan,Bioconjugate Chem.，2012, 23, 1244)等被先后研制了出来。这几种配位体不仅可与三价铕离子形成稳定 的强荧光性配合物，其氯磺酰基还可与含有氨基的生物分子共价键合，进而对生物分子进 行荧光标记。其中BHHCT已经被商品化，根据BHHCT的结构而改造研制的BHHBCB相对于目 前已有的三价铕离子荧光配合物具有更佳的荧光性质。研究发现，三价铕离子的BHHCT配 合物以及由其衍生而来的配合物，不仅在生物标记方面具有很好的应用价值，而且其在功 能性纳米稀土荧光材料的制备及复杂样品的时间分辨荧光生物成像测定方面也具有很好 的应用价值。
[0005] 虽然BHHCT以及BHHBCB为代表的配合物已经研制出来，但是由于目前稀土离子 荧光配合物仍然种类有限，商品化的探针价格昂贵，而且这些配合物的激发波长均很短 (360nm以下)，所以对于BHHCT等化合物的结构进行优化设计，制备具有更优荧光性质与稳 定性的配合物仍具有很大的意义。
[0006] 本发明在对BHHBCB配位体结构设计的基础上，设计合成出一种新型的含有1，3二 苄基苯骨架结构的四齿0 -二酮-铕(III)荧光配合物，并建立了蛋白质标记的应用方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种新型的含有1，3二苄基苯骨架结构的四齿(6-二酮-铕 (III)荧光配合物标记探针，并将其用于蛋白质分子标记和AFP(甲胎蛋白）抗原的测定。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 以三价铕离子与一种氯磺酰化四齿P_二酮类配位体所形成的荧光配合物为生 物标记分子探针，其结构为：
[0010]
[0011] R1为氯磺酰基（-SO2Cl)、异硫睛基（-NCS)、氨基（-NH2)、肼磺酰基（-SO2NHNH2)等 可与生物分子共价反应的活性取代基，R2为CnF2n+1，其中，n=l，2, 3, 4,即三氟甲基（-CF3)、五 氟乙基（-C2F5)、七氟丙基（-C3F7)和九氟丁基（-C4F9)等取代基。
[0012] 以上结构的配位体，在弱碱性（pH>8)的缓冲溶液中可以共价键合的形式与含有氨 基的蛋白质(抗体、抗原、亲和素、链霉亲和素等)、氨基酸、肽、核酸等生物分子结合，当在溶 液中加入三价铕离子后，铕离子可以与结合在生物分子上的配位体形成稳定的强荧光配合 物，进而得到铕(III)荧光配合物标记的生物分子，以用于各种时间分辨荧光测定。
[0013] 所述四齿P-二酮配位体-EU3+在时间分辨荧光测定法中的应用，其中的时间分辨 荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法或时间分辨荧光DNA杂交测定法。所述四齿(6-二 酮配位体-Eu3+作为标记物应用在临床诊断用试剂盒中。
[0014] 本发明的荧光探针具有如下优点：
[0015] 1.合成步骤简单，原料易得，成本低。
[0016] 2.相对于已报道的三价铕离子氯磺酰化四齿(6-二酮荧光配合物生物标记探针 荧光发光更强（荧光量子产率可以达到36%)，荧光寿命更长（0. 84ms)。
[0017] 3.作为荧光探针，具有高的稳定性，能长期保存使用。
[0018] 4.生物分子的荧光标记方法操作简单。
[0019] 5.水溶液中标记生物分子后仍具有强荧光和长荧光寿命，可用于高灵敏度时间分 辨成像测定。
【附图说明】
[0020] 图1是该种四齿P-二酮配位体（R1=SO2Cl,R2=C3F7)的合成路线。
[0021] 图2是1，3-二(七氟代丙基邻-二酮基-对苄基）苯的质谱分析结果 (734+Na=756)。
[0022] 图3是第一步产物1,3-二（4' -乙酰基苄基）苯与第二步产物1,3-二(七氟代丙 基-P-二酮基-对苄基）苯的红外谱图对比。
[0023] 图4是MQT-I-Eu3+标记碳纳米粒子后在碳酸缓冲溶液中以330nm激发的复合发射 光谱。
[0024] 图5是MQT-I-Eu3+标记BSA在pH7. 8的0? 05MTris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧 光激发与发射光谱。
[0025] 图6是MQT-I-Eu3+标记BSA在pH9. 1的0. 05M硼酸缓冲溶液中的时间分辨荧光激 发与发射光谱。
[0026] 图7是MQT-I-Eu3+作为荧光探针检测AFP的工作曲线。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例仅用于对本发明进行说明，基 于相同原理和类似原料的方法也属于本发明的范围。
[0028] 实施例1 :一种氯磺酰化四齿P_二酮配位体的合成该种氯磺酰化四齿P_二酮 配位体的合成路线如图1所示，具体实验过程如下。
[0029] (1) 1，3-二（4' -乙酰基苄基）苯的合成。
[0030] 将I.Og(3. 8mmol) 1，3_ 二（漠甲基）苯，2. 23g(13. 68mmol) 4_ 乙醜基苯砸酸， 2. 62g( 19mmol)碳酸钾加入含有60ml丙酮及20ml水的圆底烧瓶中，在冰水浴冷却下搅拌至 大部分溶解，再加入26. 94mg(0. 15mmol)氯化钯，氩气保护下加热至50°C，搅拌12小时。反 应结束后旋蒸除去溶剂，生成物用氯仿萃取，经无水硫酸钠干燥后蒸干滤液得粗产品。粗产 品以石油醚-乙酸乙酯（4:1)为洗脱液过硅胶柱提纯，真空干燥，得目标产物863. 5mg，产率 66.44%/HNMR(CDCl3)测定结果：8=7.86 (d，J=8. 0Hz，4H)，7. 28-7. 24 (m，4H)，7. 01-7. 03 (m，4H)，3.98 (s，4H)，2.57 (s，6H)。
[0031] (2) 1，3-二(七氟代丙基-(6-二酮基-对苄基）苯的合成
[0032] 将I.Og(2. 92mmol) 1，3-二（4' -乙酰基苄基）苯和2. 04g七氟丁酸乙酯 (8. 75mmol)溶于30ml的干燥乙醚中，加入0. 47g(8. 75mmol)甲醇钠，室温搅拌反应42 小时。反应结束后加入20ml的15%硫酸水溶液，搅拌20分钟，蒸出乙醚，过滤收集沉淀， 并用水充分洗涤。粗产物用无水乙醇重结晶后真空干燥，即得到目标产物1，3-二(七氟 代丙