一种分子印迹材料的合成方法及其在烟叶中茄尼醇分离中的应用
【技术领域】
[0001] 发明了一种天然产物中活性成分的提取方法，即将分子印迹聚合物用于制 备色谱，从天然产物中直接提取高纯度的活性成分，即分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)结合中低压制备色谱（Flash Chromatography)的体系，用于 天然产物中活性成分的快速、大量制备。
【背景技术】
[0002] 分子印迹聚合物是指由功能单体、模板分子、交联剂之间通过相互作用形成的聚 合物。其携带有对模板的上亿个特异性结合位点，能够识别和特异性结合目标物。分子印 迹聚合物因其对特定分子的特异性识别和选择性结合能力，可用于众多领域，包括分离和 纯化、传感及生物传感、催化、药物载体等。就其分离和纯化应用来说，分子印迹近年来被广 泛应用于固相萃取，用于分析检测前样品的富集和纯化，但很少有其在大批量制备方面的 应用。
[0003] 制备色谱的首次报道是在1879年，由W. C. Still用于在有机合成后目标物的纯 化。因其具有低成本、耗时短、高产等优点，此后被广泛应用于有机反应后处理、天然产物提 取、样品富集和纯化等。但是传统固定相（如硅胶、聚酰胺、氧化铝、水凝胶等）的固有缺陷 如吸附性低、寿命短等严重影响其产物的纯度和分离成本。
[0004] 从天然产物中提取高纯度的有效成分一直研究热点，为此近年来研究者已开发出 很多色谱技术，如高速逆流色谱、超临界流体色谱、模拟移动床色谱等，成功用于天然产物 中活性成分如皂苷、百里香、甘草酸、链留醇等的分离，产物纯度可达95%。然而以上色谱技 术因耗时、溶剂需求量大、成本高等，在大量制备方面并未得到广泛应用。
【发明内容】
[0005] 本发明将分子印迹技术和制备色谱结合起来，目的是为天然产物中活性成分的提 取，提供一种快速、大量的制备方法，以解决传统方法成本高、步骤复杂、产物纯度低等问 题。
[0006] 技术方案如下：
[0007] 正向悬浮聚合的制备茄尼醇分子印迹聚合物：将一定量的模板、单体、交联剂溶于 有机溶剂，得到分散相；连续相：将一定量表面活性剂溶于超纯水中。制备条件：在一定机 械搅拌速度下、惰性气体除氧、50~90°C下、聚合3~8小时。
[0008] 优化后的分子印迹制备色谱条件，用于提取烟叶中茄尼醇。其具体方法操作如下： 将粗提的烟叶萃取物用有机溶剂定容至一定浓度，以一定流速上样，切换流动相用洗脱溶 剂以一定流速洗脱，最后用有机溶剂冲净系统中的洗脱溶剂，收集洗脱部分，经旋转蒸发， 得到白色固体，即茄尼醇。
[0009] 本发明的优点：
[0010] (1)本实验的原料为烟叶，其来源稳定，成本低廉，并且预处理方法简便；
[0011] (2)本提取方案提取效率，产物纯度高达98 %，提取溶剂可以回收使用，极大降低 了成本而且避免了环境污染；
[0012] (3)本实验中所用的分子印迹聚合物，吸附性强、选择性高、使用寿命长，可重复利 用；
[0013] (4)本实验所建立的天然产物的提取方法，具有普适性，可用于其他天然产物中活 性成分的提取，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为优化配方后的茄尼醇印迹聚合物（MIP3)电镜图。由图可知茄尼醇印迹聚 合物和非印迹聚合物都具有良好的球形度，粒径范围为250-350 μ m，并且印迹聚合物表面 比非印迹聚合物粗糙。
[0015] 图2图为茄尼醇分子印迹制备色谱色谱条件优化，其中a)图为上样流速对吸附率 的影响。b)图为洗脱流速对洗脱率的影响，从中分别可知最佳上样流速及洗脱流速。图c) 为洗脱溶剂对洗脱率的影响，从中可知最佳洗脱溶剂比例。
[0016] 图3a)图为茄尼醇分子印迹制备色谱，用于分离烟叶粗提物时的制备色谱图。其 中虚线为甲苯测量该制备色谱上样死时间；实线部分为烟叶粗提物的制备色谱图，第一个 峰为其过载峰；第二个平台为茄尼醇溶液的洗脱峰。
[0017] 图3b)为实验中洗脱液、过载液、茄尼醇标品和烟叶粗提液的液相色谱图。由图可 知，烟叶粗提液成分复杂，在茄尼醇附近存在干扰，而本实验建立的方法可从中分离得到高 纯度的茄尼醇。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过一些实施例对本发明作进一步说明，但本发明不只限于下面的例子。
[0019] (1)茄尼醇液相色谱条件确定
[0020] 茄尼醇高效液相色谱条件：色谱柱及型号卩1^1'0311^ 300-5-〇8- SH(4. 6X250mm，5ym);流动相为甲醇/水（98/2，v/v);流速为lml/min，柱温为25°C;进样 量为10 μ 1 ;紫外检测波长为210nm。配制浓度分别为0. 01、0. 05、0. 1、0. 5、l、2mM的茄尼醇 甲醇标准溶液，用以上色谱条件进行高效液相色谱（见说明书附图3b)检测，以浓度对应的 峰面积绘制标准曲线为y = 3X106x+104731，线性相关系数R2= 0. 9988,在此0. 01-2. OmM 范围内线性关系良好。
[0021] (2)茄尼醇印迹聚合物的制备
[0022] 为制备得到球形度良好的印迹聚合物，茄尼醇分子印迹聚合物的制备采用悬浮聚 合，过程分为有机相和水相的制备。经过试验配方优化（优化方案见表1)，MlPj^制备步 骤如下，将模板、单体、交联剂在有机溶剂中混匀超声溶解，再加入引发剂超声溶解，通入惰 性气体排除液体中的空气；水相的制备：将表面活性剂溶解到超纯水中，并通入惰性气体 排除液体中的空气。两相制备完毕后，将有机相在机械搅拌下，缓慢滴加到水相中，在惰性 气体保护的条件下一定温度下聚合，反应结束后过滤得到印迹因子为3. 9的茄尼醇印迹聚 合物。非印迹聚合物（Nonimprinted Polymers, NIPs)的制备除了不加入模板分子，制备方 法同MIPs。
[0025] 表1为茄尼醇四种印迹聚合物的配方，及其在固相萃取实验中对应的吸附率、洗 脱率及印迹因子。由表1可知，MIP3对茄尼醇的吸附率最高，并且具有最高的印迹因子，因 此选择MIP3为后续实验中聚合物。
[0026] (3)茄尼醇分子印迹聚合物的吸附及形貌表征
[0027] 前尼醇MIPs的吸附表征：利用分子印迹固相萃取实验来对前尼醇印迹及非印迹 聚合物对茄尼醇的动态吸附性能，为后续制备色谱应用奠定基础。茄尼醇分子印迹聚合物 固相萃取柱的制备方法如下：将25g聚合物紧密置于固相萃取柱中，用有机溶剂活化。随 后上样，待样品流干后用有机溶剂淋洗未吸附物质，并用干燥离心管收集淋洗液，等其流干 后，用洗脱溶剂洗脱，并用干燥离心管收集洗脱液，待其流干后，将淋洗液和洗脱液在35°C 下用氮吹仪吹干，用有机溶剂定容，超声溶解后，用高效液相色谱检测其浓度。三组平行实 验后，测量并计算洗脱率、吸附率、相对标准偏差（RSD)(吸附实验结果见附图表1)。实验 结果表明当聚合物祖匕对茄尼醇的吸附率最高，并且具有最高的印迹因子，后续实验中以 MIPs 指代 MIP3。
[0028] 茄尼醇MIPs的形貌表征：用扫描电镜（SEM)对茄尼醇聚合物（MIP3)的形貌进行 表征。电镜图（见附图1)茄尼醇印迹聚合物和非印迹聚合物都具有良好的球形度，粒径范 围为250-350 μ m，并且印迹聚合物表面比非印迹聚合物粗糙。此外还对聚合物进行了 BET 比表面积测试，测试条件如下，选择加热一抽真空脱气模式，50°C脱气60min，25°C下氮气吸 附，饱和蒸汽压为1. 1140bar。BET结果表明，茄尼醇MIPs