r>[0031] 3、对扩增产物进行分离检测，具体操作步骤如下：
[0032] 1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装 板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
[0033] 2)制备12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板 间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
[0034] 3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用 装满0. 5XTBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0. 5XTBE，预电泳20min ;
[0035] 4)样品电泳，吸取7uL PCR产物，加入4uL 2 X loading buffer，快速离心混合， 95°C变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4°C，35W，电泳6-7h ;
[0036] 5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL双蒸水洗胶4次；
[0037] 6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速 洗胶4次；
[0038] 7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入 500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
[0039] 8)读取条带，确定基因型。
[0040] 下面结合实例对发明做进一步说明：
[0041] 利用Betal085E2F/Betal085E2R引物对不同扬子鳄个体MHC基因进行扩增：
[0042] 1. DNA提取：从-20 °C冰箱中取出加有EDTA抗凝的扬子鳄血液样品，解冻，取 20 μ L于1. 5mL离心管中，消化过夜后，用酚-氯仿抽提法提取血液样品中的基因组DNA。用 分光光度计检测提取所得DNA溶液的浓度，用1 %琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNA marker 检测提取所得DNA片段的长度范围及质量，取些许DNA原液稀释至浓度约为200ng/ μ L的 稀释液，-20°C条件下保存。
[0043] 2. PCR扩增：以合格的DNA稀释液为模板，利用本发明设计的Betal085E2F/ Betal085E2R引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为10 yL :扬子鳄基因组DNA稀释液0. 8 yL， 上下游引物各〇·2 μ L，超纯水4.4 μ L，2 XUltraTaq Master Mix 4.4 μ L。PCR反应程序为： 95 °C预变性5分钟，95 °C变性30秒，63 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共34个循环，最后72 °C 延伸10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNA marker检测扩增产物的质量，结果显 示，该对引物均能在扬子鳄DNA样品中顺利扩增得到明亮的单一条带，展现了稳定的位点 特异扩增能力。
[0044] 3.对PCR产物进行SSCP分型，步骤如下：
[0045] 1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装 板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
[0046] 2)制备12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板 间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
[0047] 3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用 装满0. 5XTBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0. 5XTBE，在35W功率下预电泳 20min ；
[0048] 4)样品电泳，吸取7uL PCR产物，加入4uL 2 X loading buffer，快速离心混合， 95°C变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4°C，35W，电泳6h30min ;
[0049] 5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL双蒸水洗胶4次；
[0050] 6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速 洗胶4次；
[0051] 7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入 500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
[0052] 8)读取条带，确定基因型。
[0053] 4.读取的SSCP分型结果如图2显示，扬子鳄MHC基因在Betal085E2F/ Betal085E2R扩增位点上显示出三种不同的带型，根据带型可分为AA型，BB型以及AB型。
【主权项】
1. 一对用于扬子鳄抗细菌潜力检测的II类MHC基因的单位点特异性扩增引物，引物的 名称及具体序列下： 上游引物：Betal085E2F:CTCTGCCCAGTAGGAGCCGTGC; 下游引物：Betal085E2R:AACAAAGACCCCAGGAATCCAG。2. -种扬子鳄抗细菌潜力检测的II类MHC基因的分型方法，其特征在于采用权利要求 1所述PCR引物对，进行PCR反应，每对引物均在10μLPCR体系中进行目标片段扩增，然后 将扩增产物分别利用SSCP进行基因分型。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的10μLPCR体系为：扬子鳄个体基因 组0嫩0.8 4 1^，上下游引物各0.2 4 1^，超纯水4.4 4 1^，2\1]1七抑丁&9]\&18七6『]\^叉4.4 4 1^。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的程序为：95°C预变性5分 钟，95 °C变性30秒，63 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共34个循环，最后72 °C延伸10分钟。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法中，固定后、银染后以 及显色后应分别使用双蒸水洗胶4次，以获得清晰的SSCP条带。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型的方法是： 1) 用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将 间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上； 2) 制备12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确 认无气泡存在后插入梳子，常温平置； 3) 待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满 0. 5XTBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0. 5XTBE，预电泳20min; 4) 样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2Xloadingbuffer，快速离心混合，95°C变 性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4°C，35W，电泳6-7h; 5) 将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入 500mL双蒸水洗胶4次； 6) 加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶 4次； 7) 加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固 定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次； 8) 读取条带，确定基因型。
【专利摘要】本发明涉及一对用于扩增扬子鳄抗细菌潜力检测的Ⅱ类主要组织相容性复合物基因的单位点特异性引物及分型方法，引物的具体序列如SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.2所示。本发明的扩增引物，在扬子鳄种群内具有稳定的单位点特异扩增能力，其扩增得到产物可以通过后续的单链构象多态性检测(single？strand？conformation？polymorphism,SSCP)实验对不同的个体进行基因分型，实现对种群中扬子鳄个体Ⅱ类MHC基因多态性的评估，检测其抵抗细菌性疾病的潜力，为扬子鳄保护工作中的新种群奠基者选择、野化放归个体选择以及人工配对等工作提供重要参考。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105316409
【申请号】CN201510738232
【发明人】方盛国, 万秋红, 翟腾
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月3日