VH区相较于PR0165的VL和VH区包含至少一个序列变 化。在特定实施方案中，所述功能活性变体的CDR序列与PR0165的VL和VH区的CDR序列 至少70 %，具体来说至少80 %，更具体来说至少90 %同源。最具体来说，所述功能活性变 体的⑶R序列与PR0165的VL和VH区的⑶R序列至少90 %相同以及至少95%同源。在特 定所述实施方案中，所述功能性变体的VH区的至少CDR3区与PR0165的相应CDR3区相同。 在更特定实施方案中，所述功能性变体的所有CDR区都与PR0165的相应CDR区相同。
[0076] 在另一方面，本发明涉及编码本发明的双特异性构建体的一种核酸或多种（即一 种以上）核酸。如果双特异性构建体是单链构建体，例如多肽或蛋白质，那么单一核酸编码 该双特异性构建体。然而，如果双特异性构建体包含两个或更多个多肽，那么本发明的双特 异性构建体也可由两种或更多种单独核酸编码。本发明的核酸分子可为任何核酸分子，具 体来说DNA或RNA分子，例如cDNA或mRNA。它们可为天然存在的分子或通过基因工程改造 或化学合成产生。它们可为含有编码或非编码链的单链分子、或双链分子。
[0077] 在本发明的一特定实施方案中，所述一种或多种核酸编码双特异性构建体 PR0165(SEQ ID N0:7)或其功能活性变体。
[0078] 本发明的核酸可通过如为本领域技术人员所知的任何适合方法来产生。本发明 的核酸可例如通过亚磷酰胺方法等来合成，或可通过使用特定引物进行聚合酶链式反应 (PCR)来产生。此外，用于将所需突变引入某些核苷酸序列中的方法（如定点诱变技术）为 本领域技术人员所熟知。
[0079] 在另一方面，本发明涉及包含本发明的核酸的一种载体或多种载体。当包含在载 体，具体来说质粒内时，核酸具体来说是DNA。不特定限制用于本发明中的载体的类型。举 例来说，载体可为自主复制的载体，如质粒，或可为当引入宿主细胞中时整合至宿主细胞的 基因组中，并且连同染色体一起复制的载体。具体来说，用于本发明中的载体是表达载体， 具体来说表达质粒。在表达载体中，为转录所必需的元件（如启动子）被操作性地连接于 本发明的DNA核酸。
[0080] 在细菌细胞中具有操作性的启动子的实例包括噬菌体λ的PR或PL启动子、大肠 杆菌的lac、trp或tac启动子等。哺乳动物启动子的实例包括SV40启动子、MT-I (金属硫 蛋白基因）启动子、腺病毒2主要晚期启动子等。此外，用于昆虫细胞中的示例性启动子包 括多角体蛋白（polyhedrin)启动子、PlO启动子、杆状病毒即刻早期基因1启动子等。此 外，适于酵母宿主细胞的启动子包括源于酵母糖酵解系统基因的启动子、TPIl启动子等。适 于不同表达系统的其它启动子在本领域中是已知的。
[0081] 此外，必要时，可使本发明的DNA操作性地连接于适合终止子，如人生长激素终止 子或TPI1ADH3真菌宿主终止子。本发明的重组载体也可具有如聚腺苷酸化信号（例如源于 SV40)、转录增强子序列（例如SV40增强子）或翻译增强子序列（例如编码腺病毒VA RNA) 的元件。
[0082] 本发明的重组载体通常也具有使得载体能够在宿主细胞的内部复制的DNA序列， 并且其用于哺乳动物细胞的实例是SV40复制起点。此外，本发明的重组载体也可含有可选 择标志物。可选择标志物的实例尤其包括如氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素和 潮霉素的药物抗性基因。用于使本发明的核酸与启动子以及需要时的其它调控序列（如终 止子和/或分泌信号序列）连接，以及将这些元件插入适合载体中的方法为本领域技术人 员所知。
[0083] 在本发明的一特定实施方案中，所述一种或多种载体包含一种或多种编码双特异 性构建体PR〇165(SEQ ID N0:7)或其功能活性变体的核酸。
[0084] 在另一方面，本发明涉及包含本发明的载体的一种宿主细胞或多种不相同宿主细 胞。不特定限制向其中引入本发明的重组载体的宿主细胞，并且包括可表达本发明的载体 的任何原核或真核细胞。适合宿主细胞的实例包括细菌（例如杆菌属（Bacillus)种、链霉 菌属（Streptomyces)种和大肠杆菌）、哺乳动物细胞（例如册1(293、他1^、0)3、8册、01和 CHO细胞）、昆虫细胞（例如杆状病毒表达系统）、酵母细胞（酵母属（Saccharomyces)种或 裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)种，具体来说酿酒酵母（Saccharomyces cerevisae) 和克鲁维酵母（Saccharomyces kluyveri))和其它真菌细胞（例如曲霉属（Aspergillus)、 链孢霉属（Neurospora))。具体来说，细胞是细菌细胞，具体来说大肠杆菌细胞。
[0085] 可在单一宿主细胞表达系统中制备多重多肽链双特异性构建体，其中宿主细胞产 生双特异性构建体的各链，并且将多肽链装配成多聚结构以形成双特异性构建体，随后从 宿主细胞回收双特异性构建体。或者，可在单独表达宿主细胞中制备所需双特异性构建体 的单独多肽链，从相应宿主细胞分别回收，接着在如本领域中所知的允许形成多亚单位双 特异性构建体的条件下体外混合。
[0086] 用于将本发明的载体引入适合宿主细胞中的方法在本领域中是已知的，并且包括 原生质体方法、感受态细胞方法（用于细菌宿主细胞）、电穿孔、磷酸钙方法、脂质体转染 (用于哺乳动物细胞或用于昆虫细胞/杆状病毒系统）、电穿孔、原生质球方法和乙酸锂方 法（用于酵母和其它真菌宿主细胞）。
[0087] 在另一方面，本发明涉及一种用于产生本发明的双特异性构建体的方法，其包括 提供一种或多种本发明的宿主细胞，培养所述一种或多种宿主细胞，以及从细胞培养物收 集双特异性构建体。在培养步骤中，在适合培养基中在允许表达本发明的双特异性构建体 的条件下培养本发明的宿主细胞。用于培养细胞的培养基可为适于使宿主细胞生长的任何 常规培养基，如含有适当补充物的基本或复合培养基。或者，本发明涉及一种用于产生本发 明的双特异性构建体的方法，其包括提供一种或多种本发明的核酸、或一种或多种本发明 的载体，具体来说在体外转录/翻译系统中表达所述一种或多种核酸或所述一种或多种载 体（参见例如Yin等，Mabs 2012年3月1日；4 (2) 217-25)，以及从表达系统收集所述双特 异性构建体。
[0088] 在从细胞培养物收集双特异性构建体的步骤中，通过用于分离和纯化蛋白质的常 规方法回收产生的双特异性构建体，包括通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞，借助于 例如硫酸铵的盐使上清液或滤液的蛋白质组分沉淀，以及通过多种色谱程序，例如离子交 换色谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法等进行纯化。在双特异性复合物形成不溶性包涵体 的情况下，例如当使用大肠杆菌作为宿主细胞时，可首先将包涵体溶解在变性剂中，随后根 据本领域中熟知的程序进行再折叠步骤。
[0089] 在另一方面，本发明涉及一种包含本发明的双特异性构建体以及药学上可接受的 载体的药物组合物。如本文所用，术语"药学上可接受"是指那些化合物或物质在合理医学 判断的范围内适于与尤其是人的哺乳动物的组织接触，而无过度毒性、刺激、过敏应答和其 它难处理的复杂情况。如本文所用的术语"载体"涉及活性成分借此施用的稀释剂、佐剂、 赋形剂或媒介物。供在本文中使用的药学上可接受的载体可为例如无菌液体或分散液。特 定载体是适于静脉内、皮下或表面施用的那些，包括供胃肠外施用的无菌水性和非水性溶 液或混悬液，如 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版（2000)中 所讨论。
[0090] 药物组合物通常包括有效量的本发明的双特异性构建体。在本发明内，术语"有效 量"是指化合物足以实现有益或所需治疗结果的量。治疗有效量可以一次或多次施用、施加 或剂量加以施用，并且不意图限于特定制剂或施用途径。此外，药物组合物可包括一种或多 种与本发明的双特异性构建体共同施用的其它活性物质。此外，药物组合物可含有其它药 学上可接受的物质，例如药物可接受的赋形剂，如增溶剂、表面活性剂、张力调节剂等。
[0091] 此外，不特定限制本发明的药物组合物的剂型，但具体来说是胃肠外制剂，如用于 注射或输注的水性或非水性溶液或分散液；或适于表面施用的制剂。另一特定剂型是含有 于控制或持续或延迟释放基质中配制的本发明的双特异性构建体的制剂。此外，药物组合 物也可含于随时间释放双特异性构建体的可植入装置中。
[0092] 在另一方面，本发明涉及本发明的双特异性构建体用于治疗炎症性和/或自身免 疫疾病的用途。具体来说，本发明涉及一种用于治疗炎症性和/或自身免疫疾病的方法，其 包括向受试者，具体来说人患者施用有效量的本发明的双特异性构建体。术语"有效量"的 含义如本文在以上所定义。通常，有效量的本发明的双特异性构建体以上述药物组合物的 形式施用。适合施用途径包括但不限于表皮和胃肠外施用，具体来说吸入、皮下注射、静脉 内注射和向脑脊髓液中注射。不特定限制施用方案，并且包括例如每两周、每月、隔月一次、 每三个月、六个月或九个月一次以及一年一次或单次施加施用流程。
[0093] 炎症性和/或自身免疫疾病可为类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、牛皮癣 性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、全身性红斑狼疮、青少年糖尿病、自身免疫葡萄膜 炎、以及多发性硬化症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和缺血-再灌注损伤。
[0094] 实施例
[0095] 实施例1 :克降双特异件抗体构律体
[0096] 双特异性构建体VhA-LI-\B-L2-VHB-L3-\A (其中\A和VhA结构域共同形成 ⑶3 ε的抗原结合位点，并且VJ和VhB共同形成IL23R的抗原结合位点）可通过使用 Holliger 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448(1993) ;Kipriyanov 等，J. Mol. Biol. 293:41-56(1999)以及 Brilsselbach 等，Tumor Targeting 4:115-123(1999)中所述 的技术，从包含在抗体bsc⑶19x⑶3中的人源化抗⑶3 ε抗体结构域克隆AV^PVhA (参见EP 1348 715 Α2,图8,分别是核苷酸1258-1575和核苷酸847-1203)，以及从人源化抗IL23R抗 体20D7克隆\8和￥#(参见EP 2 395 025 Α1，分别是SEQ ID Ν0:9和4)，用各自由氨基 酸序列GGGGS (G4S)组成的连接体Ll和L3以及由氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (G4S) 4 组成的中间连接体L2来装配至适于在大肠杆菌中表达的表达载体中，所述表达载体包括 用于将双特异性构建体分泌至大肠杆菌宿主细胞T的周质中的N末端信号序列。
[0097] 实施例2 :IL23R在癌细朐系h的表汰水平
[0098] 可在公共领域中获得的数据表明在某些肿瘤中，IL23R可被上调。然而，可用信息 不足以将IL23R验证为通过双特异性抗IL23RX⑶3 ε抗体形式来靶向癌细胞的合适标志 物，因为绝对表达水平、表达特异性以及在不同肿瘤样品之间的IL23R上调外显率都不是 已知的。为进一步研究IL23R作为靶向溶解肿瘤细胞的标记的适合性，我们评估IL23R在 一批原发性癌组织以及广泛范围的肿瘤细胞系两者上的表达水平。惊人地，在来自结肠直 肠癌的大多数原发性组织样品中，IL23R mRNA表达水平被升高。类似地，发现在所有129 个所研究的CRC细胞系中，IL23R mRNA表达都升高。与这些研究结果一致，在所有六个所 研究的结肠直肠癌细胞系中以及在A549肺腺癌细胞系上，如通过流式细胞计量术所评估， IL23R也在蛋白质水平上被高度上调（图2和图3)。对每个细胞的IL23R拷贝的定量揭 示每个CRC细胞约10' 000 - 88' 000个拷贝的表达水平（表1)。值得注意的是，我们发 现IL23R蛋白也在被公开为关于验证的肿瘤标志物CEA和EGFR呈阴性的细胞系上强烈表 达，所述标志物是当前处于开发中的双特异性T细胞重定向抗体治疗剂所针对的两种靶标 (0sada，T.等 2010. British Journal of Cancer ; 101:124-133 ;Lutterbuese，R.等 2010. PNAS ;107:12605-12610)。我们的数据表明IL23R是在大多数结肠直肠癌中被特定上调的 肿瘤标志物，并且用于靶向溶解CRC细胞的双特异性抗IL23RX⑶3 ε抗体也在抗CEA或抗 EGFR疗法难治性患者中具有潜力。引起关注的是，我们也在多种白血病和淋巴瘤细胞系中 发现类似IL23R mRNA表达水平，并且确认所有测试细胞系中的IL23R蛋白表达都升高（图 4)〇
[0099] 表 1 :
[0100] 在癌细胞系的表面上表达的IL23R分子。AMFI，平均荧光强度差异，以及S/N，抗 IL23R抗体与同种型对照之间的信号与本底比率。ABC，如通过相对于参照标准珠粒进行回 归所确定的抗原结合能力。
[0102] 实施例3 :鉴定结合人白介素(IL)-23受体的单克隆兔抗体
[0103] 使用基于流式细胞计量术的单细胞分选，从免疫的兔体内分离总计475个特异性 结合白介素-23受体的单克隆B细胞产生抗体，所述分选的原理为专家所熟知，并且例如 由 Lalor 等 Eur J Immunol. 1992 ;22· 3001-2011 所述。首先针对与人 IL23R ECD 的结合使 单克隆B