样品分别为:
[0047](I)R G0-3，5-PANI(2)G0D+HRP双酶吸附
[0048](2)R GO-3,5-PANI (2)-FAD apo-GOD+HRP GOD 咬合，HRP 吸附
[0049](3)R G0-3,5-PANI(2)-Hemin GOD+apo-HRP HRP咬合，GOD吸附
[0050](4)R G0-3,5-PANI(2)-FAD-Hemin apo-GOD+apo-HRP G0D、HRP均咬合
[0051]由图3中数据可知，双酶均以亲和吸附法固定的方法获得的检测活性最佳。
[0052]实施例2
[0053]如实施例1相同的实施方式，调整各物质如下:
[0054]1.碳纳米管(CNT) -3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)
[0055]称取碳纳米管1.0g，置于烧杯内，加入200ml THF，超声Ih;再加入1.0g3,5-二氨基苯甲酸(?6.57 X 10—3mol)，继续超声30min ；将超声后的溶液转移至三口烧瓶中，封闭反应瓶，抽真空，充氮气，加热至70°C冷凝回流，磁力搅拌2h;反应溶液离心，并用无水乙醇洗涤沉淀数次;沉淀物置于真空烘箱中干燥。
[0056]2.CNT-3，5-DABA-聚苯胺(PANI)
[0057]称取CNT-3，5-二氨基苯甲酸0.2g，加入60ml匪P混合，超声分散；加入聚苯胺0.15g，搅拌均匀；将0.07g过硫酸铵(?3.1lX 10-W)用1ml 1.0M盐酸溶液溶解，缓慢滴加入反应瓶;滴加完成后，继续搅拌反应2h;将反应溶液离心(5000rpm，5min)洗涤数次，沉淀置于真空烘箱中干燥。
[0058]3.CNT-3，5-DABA-PAN1-黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)
[0059]称取CNT-3，5-DABA-PANI20mg，用20ml pH=5.2PBS缓冲液溶解，加入0.12g NHS和0.29g EDC，搅拌30min ；离心(lOOOOrpm，5min)，洗去未反应的EDC和NHS ；所得活化产物用pH = 7.4的I3BS缓冲液稀释至5ml，超声5min;称取1mg FAD加入，搅拌过夜;离心洗涤，真空干燥。
[0060]4.CNT-3，5-DABA-PAN1-FAD-氯化血红素(Hemin)
[0061 ]将CNT-3 ,5-DABA-PAN1-FAD取1mg，用pH = 5.27PBS缓冲液溶解稀释至1ml ；加入
0.06g NHS和0.15g EDC，搅拌30min;称取5mg Hemin加入，搅拌过夜；离心洗涤，并真空干燥。
[0062]5.还原 CNT-3，5-DABA-PAN1-FAD-Hemin
[0063]取5mgCNT-3,5-DABA-PAN1-FAD-Hemin以pH=7.4PBS缓冲液溶解至5ml，量取20ml80 %水合肼加入，搅拌反应4h;离心洗涤除去水合肼，真空干燥待用。
[0064]6.双酶反应体系的构建一葡萄糖氧化酶(G0D) +过氧化氢酶(CAT)
[0065]取已还原CNT-3,5-DABA-PAN1-FAD-Heminlmg，溶解于Iml pH=7.4PBS缓冲液，分别取Iml lmg/ml去辅基的GOD(apo-GOD)和Iml lmg/ml去辅基的CAT(apo-CAT)加入，搅拌反应30min，得到葡萄糖氧化酶(GOD)和过氧化氢酶(CAT)定向共固定化多酶体系。
[0066]经产品测试，可以高效实现多酶体系的生物活性。
[0067]实施例3
[0068]1.氧化石墨烯(G0) -3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)
[0069]称取氧化石墨稀1.0g，置于烧杯内，加入200ml THF，超声Ih;再加入1.0g3，5-二氨基苯甲酸(?6.57 X 10—3mol)，继续超声30min ；将超声后的溶液转移至三口烧瓶中，封闭反应瓶，抽真空，充氮气，加热至70°C冷凝回流，磁力搅拌2h;反应溶液离心，并用无水乙醇洗涤沉淀数次;沉淀物置于真空烘箱中干燥。
[0070]2.G0-3，5-DABA-聚苯胺(PANI)
[0071]称取G0-3，5-二氨基苯甲酸0.2g，加入60ml NMP混合，超声分散；加入聚苯胺0.15g，搅拌均匀；将0.07g过硫酸铵(?3.1lX 10-W)用1ml 1.0M盐酸溶液溶解，缓慢滴加入反应瓶;滴加完成后，继续搅拌反应2h;将反应溶液离心(5000rpm，5min)洗涤数次，沉淀置于真空烘箱中干燥。
[0072]3.G0-3，5-DABA-PAN1-黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)
[0073]称取GO-3，5-DABA-PANI20mg，用20ml 口!1=5.2?85缓冲液溶解，加入0.128 NHS和
0.29g EDC，搅拌30min;离心(lOOOOrpm，5min)，洗去未反应的EDC和NHS；所得活化产物用pH=7.4的PBS缓冲液稀释至5ml，超声5min;称取1mg FAD加入，搅拌过夜；离心洗涤，真空干燥。
[0074]4.G0-3，5-DABA-PAN1-FAD-氯化血红素(Hemin)
[0075]将G0-3，5-DABA-PAN1-FAD取1mg，用pH= 5.27PBS缓冲液溶解稀释至1ml ；加入
0.06g NHS和0.15g EDC，搅拌30min;称取5mg Hemin加入，搅拌过夜；离心洗涤，并真空干燥。
[0076]5.还原 G0-3，5-DABA-PAN1-FAD-Hemin
[0077]取5mgGO-3,5-DABA-PAN1-FAD-Hemin以pH = 7.4PBS缓冲液溶解至5ml，量取20ml80 %水合肼加入，搅拌反应4h;离心洗涤除去水合肼，真空干燥待用。
[0078]6.双酶反应体系的构建一胆固醇氧化酶+辣根过氧化物酶
[0079]取已还原CNT-3,5-DABA-PAN1-FAD-Heminlmg，溶解于Iml pH=7.4PBS缓冲液，分别取Iml lmg/ml去辅基的胆固醇氧化酶和Iml lmg/ml去辅基的辣根过氧化物酶加入，搅拌反应30min，得到胆固醇氧化酶和辣根过氧化物酶定向共固定化多酶体系。
[0080]可以高效实现多酶体系的生物活性。
【主权项】
1.一种多酶体系的定向共固定化方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一，利用带环氧键或羧基的载体材料上的功能基团，与3，5_二氨基苯甲酸的一个氨基进行反应，将3，5-二氨基苯甲酸的共价键接到载体材料上，获得接有3，5-二氨基苯甲酸的载体材料，以S-(3，5-DABA)表示;其中3，5-二氨基苯甲酸与载体材料的质量比为1_5:2； 步骤二，将步骤一得到的S-(3，5-DABA)与聚苯胺反应，反应通过S-(3，5-DABA)上氨基苯甲酸的氨基与聚苯胺反应，形成共价键，聚苯胺和S-(3，5-DABA)的质量比为1-5:10，获得接有聚苯胺的载体材料，以S_(3，5-DABA)-PANI表示； 步骤三，将黄素酶的辅基黄素腺嘌呤二核苷酸上的氨基，与步骤二所得S-(3，5-DABA)-PANI进行反应，通过S-(3，5-DABA)-PANI上苯甲酸的羧基与黄素腺嘌呤二核苷酸的氨基反应，形成共价键，载体材料与黄素腺嘌呤二核苷酸的质量比为1-5:2，经酰胺键连接，获得接有黄素腺嘌呤二核苷酸的载体，以S-(3，5-DABA)-PAN1-FAD表示； 步骤四，氧化物酶的辅基一氯化血红素上的羧基，与步骤三所得S_(3，5-DABA)-PAN1-FAD进行反应，通过S-( 3，5-DABA)-PAN1-FAD上的聚苯胺的氨基进行反应，形成共价键，所得产物以S-(3，5-DABA)-PAN1-FAD-Hemin表示;用还原剂对产物进行还原处理，还原剂与产物的质量比为8000-500:5;其中，氯化血红素与S-(3，5_DABA)_PANI_FAD的质量比为1:1_5。 步骤五，将脱辅基的黄素酶、脱辅基的过氧化物酶与步骤四中S- (3，5-DABA) -PAN1-FAD进行亲和吸附，脱辅基的脱辅基的黄素酶、脱辅基的过氧化物酶与载体的质量比为1: 1:1-5，获得定向共固定化的多酶体系。2.根据权利要求1中所述的一种多酶体系的定向共固定化方法，其特征在于，步骤一中所述的载体材料为氧化石墨稀、石墨稀、碳纳米管、或石墨中的至少一种。3.根据权利要求1中所述的一种多酶体系的定向共固定化方法，其特征在于，步骤三中所述的黄素酶为葡萄糖氧化酶(GOx)、胆固醇氧化酶、琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶、或脂酰CoA脱氢酶中的至少一种。4.根据权利要求1中所述的一种多酶体系的定向共固定化方法，其特征在于，步骤四中所述的过氧化物酶为细胞色素、过氧化氢酶、或过氧化物酶中的至少一种。5.根据权利要求1中所述的一种多酶体系的定向共固定化方法，其特征在于，步骤五中所述的还原剂为水合肼、硼氢化钠、或柠檬酸钠中的至少一种。
【专利摘要】本发明公开了一种多酶体系的定向共固定化方法。本发明利用辅基与脱辅基酶间的生物亲和作用，将多酶体系定向共固定化于一个载体上。本发明所具有的优点主要在于：实现了多酶体系的高度定向共固定化，更有利于多酶体系酶之间的协同作用，极大地提高了催化效率；定向亲和作用固定化酶比普通吸附法固定化酶活性显著提高，为进一步构建高效率、低成本的生物催化体系提供了一种可行的方法。
【IPC分类】C12N11/18, C12N11/14
【公开号】CN105441420
【申请号】CN201610013733
【发明人】叶鹏, 胡玲玲
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2016年1月8日