积，4μΜ的正向引物0.8~1体积，4μΜ的反向引物0.8~1体积，4μΜ的 探针0.5~1体积，5UAU的热启动Taq聚合酶0.2体积，其余为纯水；所述PCR缓冲液包括 100mM 的 Tr i s-HCl 和 500mM 的 KC1;所述 dNTPs 试剂包括 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP。
[0035]上述各反应体系的组分中还包括DNA模板；所述DNA模板的用量为0.5体积，所述 DNA模板的使用浓度为10~50ngAU。
[0036]上述探针a、探针b和探针c的5'端设有相互区别的报告荧光基团。所述相互区别的 报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3,第三种是Cy5或R0X;所述 探针a和探针b的淬灭荧光基团是BHQ1;所述探针c的淬灭荧光基团是MGB。
[0037]本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述检测体系的 MLH1基因启动子甲基化检测试剂盒。
[0038]本发明具有积极的效果：
[0039]本发明的检测试剂盒中：1)正向引物a和反向引物a针对未经亚硫酸盐处理的模板 进行针对管家基因的引物和探针设计;2)正向引物b和反向引物b针对MLH1启动子甲基化检 测区域上下游约200bp范围内进行设计；3)探针c针对MLH1启动子甲基化检测区域，模板此 处的CG如果变了，就表示MLH1启动子没有被甲基化，探针也结合不上去；如果此处的CG没 变，探针可以结合上去，在形成扩增产物过程中当Taq聚合酶扩增到探针结合模板的位点 时，其5'_3'核酸外切酶活性切割掉探针5'端的报告基团，游离的报告基团远离淬灭基团， 打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩 增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子(报告基团）形成，就会发一次光，保证了荧光 信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而可以检测到甲基化情况;4)因各反应不在同一管 内进行，探针a、b、c的报告荧光基团可以采用同一种。
[0040]本发明的MLH1基因启动子检测试剂盒采用荧光定量法，全程利用简单PCR反应而 非传统复杂的巢式PCR反应进行严密的质量控制，层层把控，确保模板DNA的硫化修饰质量， 实现尚通量、尚灵敏度和尚准确性的检测。具有以下特点：1)进彳丁基因组DNA质量分析的检 测体系X，利用简单PCR反应来控制模板质量，排除了对结果分析的干扰因素;2)采用转化液 质量分析的检测体系Y，并巧妙设立98%的阳性对照（含2%待检测基因组DNA)，利用简单 PCR反应来保证甲基化转化效率;也可参照98%的转化率判定方法，若需要同理经实验也可 推定其它转化率如99%的判定步骤;3)进行甲基化检测分析的检测体系Z，进一步保证了检 测体系Z的甲基化检测分析的准确性，灵敏度极高。本发明的MLH1基因启动子检测试剂盒是 准确，高通量，高敏感性的MLH1基因 CpG岛甲基化检测产品，可适应临床的广泛需求。
【附图说明】
[0041] 图1是采用反应体系X检测样本A1及其转化液Ml的扩增图；
[0042] 图2是采用反应体系Z检测阴性对照C、阳性对照E和样本A1的转化液Ml的扩增图；
[0043] 图3是采用反应体系X检测阳性对照D、样本A2及其转化液M2的扩增图；
[0044] 图4是采用反应体系Y检测阳性对照D、样本A2的转化液M2的扩增图；
[0045] 图5是采用反应体系Z检测阴性对照C、阳性对照E和样本A2的转化液M2的扩增图。
【具体实施方式】
[0046] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0047] 实施例1
[0048] 一、试剂盒的组成。
[0049] 本实施例的MLH1基因启动子甲基化检测试剂盒包括混合液X、混合液Y、混合液Z和 热启动酶(Taq Hotstar)。混合液X、混合液Y、混合液Z和热启动酶(Taq Hotstar)分别置于 不同的试管中，如表1至表3所示。
[0050] 表1混合液X的组分表
[0051 ]___
[0052] 表2混合液Y的组分表 [0053]
[0058]
[0059]
[0060] 混合液X中包括引物探针组X，混合液Y中包括引物探针组Y，混合液Z中包括引物探 针组Z。引物探针组X针对管家基因 GAPDH的序列设计且用于检测未转化DNA。引物探针组Y针 对MGMT启动子甲基化区域的目标序列设计且用于检测已转化的DNA。
[0061] 其中，正向引物a、反向引物a和探针a是针对人类GAPDH基因设计。探针a的5'端设 有R0X修饰(报告荧光基团），探针a的3 '端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团）。探针b的5 '端设有 Hex修饰(报告荧光基团），探针b的3'端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团）。探针c的5'端设有 FAM修饰(报告荧光基团），探针c的3 '端设有MGB修饰(淬灭荧光基团）。
[0062] PCR缓冲液（PCR 8叶€6〇、(1町？8、]\^(：12和热启动酶来自了31^^公司（货号： R007A)〇
[0063] 二、试剂盒的使用方法。
[0064] 本实施例的MLH1基因启动子甲基化检测试剂盒的具体检测步骤如下：
[0065] 1、DNA 提取。
[0066] 米用试剂盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep c_kit)提取样本DNA， 具体的操作参见试剂盒产品说明书。
[0067] 2、样本DNA质量检测。
[0068] 获得样本DNA后，使用微量分光光度计测量浓度，通过测定浓度和0D260/0D280的 比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本浓度为lOOng/μΙ，1.9 2 A260/280 2 1.8， A260/230 2 1.0。合格的样本DNA液即为样本A，-20°C保存。
[0069] 3、甲基化处理。
[0070] 采用甲基化处理试剂盒（EZ DNA methylation-Gold Kit，ZYM0 RESEARCH，美国， 产品编号：5005)对样本进行亚硫酸盐处理转化，具体步骤参照甲基化试剂盒说明书，得到 转化液M。
[0071] 4、准备样本及对照品。
[0072] 各样本及对照品具体成分如表5所示。
[0073]表5样本及对照品说明 「00741
[0075] B:阳性甲基化质粒。采用常规构建质粒方法构建。从随机样本里提取人类基因组 DNA液经亚硫酸盐处理，采用引物正向引物b(按照常规在5'端加酶切点的碱基序列）和反向 弓丨物b(按照常规在5'端加酶切点的碱基序列）进行PCR扩增(扩增程序如表9所示），产物测 序验证，将MLH1基因启动子没有被转化的产物作为构建阳性质粒的PCR产物1，即其MLH1基 因启动子为甲基化形式。将PCR产物1与Puc57质粒(生工A9196,编号：150311R5876-1)相应 酶切后的片段1连接，转化至DH_5a感受态细菌，LB平板培养，蓝白斑筛选出阳性克隆，测序 验证，扩大再培养，提取质粒DNA，经测序验证后，-20°C保存，保存浓度为1 OOng/μΙ。
[0076] C:阴性甲基化质粒