。采用常规构建质粒方法构建。从随机样本里提取人类基因组 DNA液经亚硫酸盐处理，采用引物正向引物b(按照常规在5'端加酶切点的碱基序列）和反向 弓丨物b(按照常规在5'端加酶切点的碱基序列）进行PCR扩增(扩增程序如表9所示），产物测 序验证，将MLH1基因启动子被完全转化的产物作为构建阴性质粒的PCR产物2,即其MLH1基 因启动子为非甲基化形式;将PCR产物2与Puc57质粒(生工A9126,编号：150311R5876-1)相 应酶切后的片段2连接，转化至DH_5a感受态细菌，LB平板培养，蓝白斑筛选出阳性克隆，测 序验证，扩大再培养，提取质粒DNA，经测序验证后，-20°C保存，保存浓度为1 OOng/μΙ。
[0077] D:98%样本B+2%样本A。其配制方法如下：以体积比B(100ng/yl) :A(100ng/yl) = 98:2配制即得。
[0078] E: 3.125 %样本B。其配制采用如下方法，以下均为体积比：
[0079] 1)以B(100ng/μl):C(100ng/μl) = l:l配制，得El，为50%B;
[0080] 2)以 El:C(100ng/μl) = l:l配制，得E2，为25%B;
[0081] 3)以 E2:C(100ngAU) = l:l配制，得 E3,为12·5%Β;
[0082] 4)以 Ε3: C( lOOng/μΙ) = 1:1配制，得 Ε4，为6 · 25 %Β;
[0083] 5)以 E4:C(100ngAU) = l:l配制，得 Ε5,为3·125%Β;
[0084] Μ:样本Α经甲基化转化试剂盒处理后的对应转化液。保存浓度为20~50ngAU。
[0085] 5、采用混合液X配制成反应体系X进行基因组DNA质量的检测。
[0086] 配制反应体系X，利用荧光PCR定量仪(Agilent 3100)对基因组DNA的质量进行检 测分析。反应体系X的组分如表6所示，反应体系X的PCR反应程序如表7所示。
[0087] 表6反应体系X的组分表
[0088]
[0089] 表7反应体系X的PCR反应程序
[0090]
[0091] 在延伸阶段收集R0X荧光信号。
[0092]采用反应体系X检测样本A，可获得典型S型扩增曲线，可确认反应体系X正常。 [0093] 6、采用混合液Y配制成反应体系Y进行转化液质量分析。
[0094]配制反应体系Y，利用荧光PCR定量仪(Agilent 3100)对转化液质量进行检测分 析。反应体系Y的组分如表8所示，反应体系Y的PCR反应程序如表9所示。
[0095] 表8反应体系Y的组分表
[0096]
[0097]
[0098] 表9反应体系Y的PCR反应程序
[0099]
[0100]在延伸阶段收集HEX荧光信号。
[0101] 采用反应体系Y检测样本B或样本C，若可获得正常S型扩增曲线，可确认反应体系Y 正常。
[0102] 7、采用混合液Z配制成反应体系Z进行甲基化检测分析。
[0103] 配制反应体系Z，利用荧光PCR定量仪(Agilent 3100)，进行甲基化检测分析。反应 体系Z的组分如表10所示，反应体系Z的PCR反应程序如表11所示。
[0104] 表10反应体系Z的组分表 「01051
[0106] 表11反应体系Z的PCR反应程序
[0107]
[0108] 在延伸阶段收集FAM荧光信号。
[0109] 采用反应体系Z检测样本B和样本D，若均能获得正常S型扩增曲线，则确认反应体 系Z工作正常。反应体系Z可检测MLH1启动子区的低至3.125 %的甲基化状态。
[0110] 三、结果判断。
[0111] 以下反应体系X、Y、Z进行检测时，均以不加 DNA模板(补足水)的PCR液为空白对照， 按以下步骤进行。
[0112] 1、采用反应体系X检测样本A。
[0113] i.反应体系X检测样本A，若不能获得正常S型扩增曲线，表明样本A的质量不合格， 需重新制备后再进行检测；
[0114] ii.反应体系X检测样本A，若获得正常S型扩增曲线，则进行步骤2的检测。
[0115] 2、反应体系X检测样本M。
[0116] i .反应体系X检测样本Μ，若不能获得典型S型扩增曲线，表明临床样本基因组DNA (样本Α)的转化液(样本Μ)无人类基因组残留，转化率100%。可直接进行步骤6的反应体系Ζ 的检测。
[0117] ii.反应体系X检测样本M，若能获得典型S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTx-m，则有 两个可能：
[0118] A.样本A的GAPDH启动区可能为完全甲基化样本;但因反应体系X所采用的引物是 针对GATOH这个管家基因的，管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化从而一直处于活 性转录状态，样本A的GAPDH启动区不可能完全甲基化，故排除这种可能性。
[0119] B.样本A的转化未进行完全，必须进行转化率的判定，进行步骤3~5。
[0120] 3、采用反应体系X检测样本D。
[0121 ]采用反应体系X检测样本D，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值命名为CTx-D。
[0122] 4、采用反应体系Y检测样本D。
[0123] 采用反应体系Y检测样本D，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTy-d。
[0124] 5、采用反应体系Y检测样本M。
[0125] 采用反应体系Y检测样本Μ，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTy-m，需进 行样本A的转化率是否大于98%转化率的判定：
[0126] Δ Ctl=CTY-d-CTx-d; Δ Ct2 = CTY-m-CTx-μ。
[0127] Δ ACT = _(实验组 ACT 值-对照组 ACT 值）=-( ACt2_ACtl)。
[0128] 若Δ ACT>0,说明临床样本基因组DNA(样本A)转变为转化液（即样本Μ)的转化率 大于98 %，可进行反应体系Ζ的检测(步骤6)。
[0129] 若Δ ACT〈0,应重新转化或者更换新的临床样本基因组DNA，重新开始检测。
[0130] 6、采用反应体系Z检测样本M。
[0131] 以样本C为阴性对照，以样本E为阳性对照。
[0132] 采用反应体系Z检测样本Μ，若获得正常S型扩增曲线，表明样本A的MLH1基因启动 子为甲基化；
[0133] 采用反应体系Z检测样本Μ，若未获得S型扩增曲线，表明样本A的MLH1基因启动子 为非甲基化。
[0134] 四、应用示例。
[0135] 1、应用例。
[0136] (1)采用本实施例的试剂盒检测样本A1的MLH1基因启动子甲基化状态。
[0137] 反应体系X检测:采用反应体系X检测样本A1及其转化液Ml的扩增图如图1所示。反 应体系X检测样本A1，获得正常S型扩增曲线;反应体系X检测转化液Ml，不能获得正常S型扩 增曲线，表明样本A1转化完全，接下来可直接进行反应体系Z的检测。
[0138] 反应体系Z检测:采用反应体系Z检测样本C(阴性对照）、样本E(阳性对照）和样本 A1的转化液Ml，扩增图如图2所示。采用反应体系Z检测样本A1的转化液Ml，得到S型扩增曲 线，可判断样本A1的MLH1基因启动子为甲基化状态。
[0139] (2)采用本实施例的试剂盒检测样本A2的MLH1基因启动子甲基化状态。
[0140] 反应体系X检测：采用反应体系X检测阳性对照样本D2、样本A2及其转化液M2的扩 增图如图3所示。
[0141 ]反应体系X检测样本A2，获得正常S型扩增曲