供其生存和扩增所需要的营养成分；完全培养液含有 2mM Gluta-MAX、100 μ g/ml 青链霉素，其余为 GMP CellGroR DC Serum-freeMedium与胎牛血清的混合物；其中GMP CellGroR DC Serum-free Medium与胎牛血清摩尔比为19:1 ；
b、取室温淋巴细胞分离液50ml，将200ml备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心，离心条件为2500rpm, 15mins，形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，离心条件为2000rpm, 5mins，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤二次，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养基重新悬浮，台盼蓝染色，细胞计数板计数，调整活细胞浓度至0.5X106cells/ml,;
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于培养体系中加入⑶16单抗，ATG，IL-2记为第一天，使得ATG浓度为50ng/ml，CD16单抗浓度为2 μ g/ml ;IL_2浓度为200U/ml，均为所占培养体系的浓度。将细胞培养板放入37°C培养箱中孵育2天，更换完全培养液，添加新鲜IL-2，使IL-2所占培养体系的浓度为200U/ml ;
g、2天更换一次培养液，继续培养21天，得到人自然杀伤细胞。
[0032]以上操作均需在GMP条件下完成，以确保NK细胞生长的无菌环境。
[0033]参见图1，经检测，本实施例中的⑶3-⑶56+NK细胞，扩增后比例高达85%。
[0034]
实施例2:
一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括以下步骤:
a、配制细胞完全培养液，备用，为NK细胞提供其生存和扩增所需要的营养成分；完全培养液含有 2mM Gluta-MAX、100 μ g/ml 青链霉素，其余为 GMP CellGroR DC Serum-freeMedium与胎牛血清的混合物；其中GMP CellGroR DC Serum-free Medium与胎牛血清摩尔比为4:1 ；
b、取室温淋巴细胞分离液300ml，将200ml备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心，离心条件为1200rpm, 25mins，形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，离心条件为800rpm, 15mins，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤三次，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养基重新悬浮，台盼蓝染色，细胞计数板计数，调整活细胞浓度至2X 106cells/ml，；
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于培养体系中加入⑶16单抗，ATG,IL-2，使得ATG浓度为1000ng/ml，CD16单抗浓度为100 μ g/ml ;IL_2浓度为1000U/ml，均为所占培养体系的浓度，记为第一天；将细胞培养板放入37°C培养箱中孵育4天，更换完全培养液，添加新鲜IL-2，使IL-2所占培养体系的浓度为1000U/ml ;
g、3天更换一次培养液，继续培养25天，得到人自然杀伤细胞。
[0035]以上操作均需在GMP条件下完成，以确保NK细胞生长的无菌环境。
[0036]经检测，本实施例中的⑶3-⑶56+NK细胞，扩增后比例高达83%。
[0037]
实施例3:
一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括以下步骤:
a、配制细胞完全培养液，备用，为NK细胞提供其生存和扩增所需要的营养成分；完全培养液含有 2mM Gluta-MAX、100 μ g/ml 青链霉素，其余为 GMP CellGroR DC Serum-freeMedium与自体血清混合物，其中，自体血清占完全培养液体积的1% ；
b、取室温淋巴细胞分离液100ml，将200ml备用人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心，离心条件为1800rpm, 20mins，形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，离心条件为1200rpm, lOmins，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤二，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养基重新悬浮，台盼蓝染色，细胞计数板计数，调整活细胞浓度至1 X 106cells/ml,;
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于培养体系中加入⑶16单抗，ATG,IL-2，使得ATG浓度为500ng/ml，CD16单抗浓度为5 μ g/ ml ;IL_2浓度为500U/ml，均为所占培养体系的浓度，记为第一天；将细胞培养板放入37°C培养箱中孵育3天，更换完全培养液，添加新鲜IL-2，使IL-2所占培养体系的浓度为500U/ml ;
g、2天更换一次培养液，继续培养20天，得到人自然杀伤细胞。
[0038]以上操作均需在GMP条件下完成，以确保NK细胞生长的无菌环境。
[0039]经检测，本实施例中的⑶3-⑶56+NK细胞，扩增后比例高达88%。
[0040]
实施例4:
一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括以下步骤: a、配制细胞完全培养液，备用，为NK细胞提供其生存和扩增所需要的营养成分；完全培养液含有 2mM Gluta-MAX、100 μ g/ml 青链霉素，其余为 GMP CellGroR DC Serum-freeMedium与自体血清混合物，所述自体血清占完全培养液体积的15% ；
b、取室温淋巴细胞分离液150ml，将200ml备用人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心，离心条件为1500rpm, 23mins，形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，离心条件为1500rpm, 8mins，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤三次，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养基重新悬浮，台盼蓝染色，细胞计数板计数，调整活细胞浓度至1.5X106cells/ml,;
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于培养体系中加入⑶16单抗，ATG，IL-2使得ATG浓度为800ng/ml，CD16单抗浓度为50 μ g/ml ;IL_2浓度为800U/ml，均为所占培养体系的浓度，记为第一天；将细胞培养板放入37°C培养箱中孵育4天，更换完全培养液，添加新鲜IL-2，使IL-2所占培养体系的浓度为800U/ml ;
g、3天更换一次培养液，继续培养24天，得到人自然杀伤细胞。
[0041]以上操作均需在GMP条件下完成，以确保NK细胞生长的无菌环境。
[0042]经检测，本实施例中的⑶3-⑶56+NK细胞，扩增后比例高达90%。
[0043]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，其特征在于，包括以下步骤: a、配制细胞完全培养液，备用；所述完全培养液含有2mMGluta_MAX和100 μ g/ml青链霉素，其余为 GMP CellGroR DC Serum-free Medium 与胎牛血清混合物或 GMP CellGroR DCSerum-free Medium与自体血清混合物； b、取室温淋巴细胞分离液，将备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心，形成细胞分层； c、吸取所述步骤b所得所述细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，得白膜层细胞团； d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤，弃去上层清液，得到细胞； e、将所述步骤d所得的细胞用步骤a所配制的完全培养液重新悬浮，计数并调整活细胞浓度至 0.5X 106-2X 106 cells/ml ； f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于细胞培养板中加入⑶16单抗，ATG，IL-2记为第一天；将所述细胞培养板放入37°C培养箱中孵育适当时间后，更换所述完全培养液，第二次添加新鲜IL-2 ; g、之后定期更换所述细胞完全培养液，培养适当时间，得到人自然杀伤细胞。2.根据权利要求1所述的人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，其特征在于，所述步骤a中，所述GMP CellGroR DC Serum-free Medium和所述胎牛血清体积比为19:1?4:1。3.根据权利要求1所述的人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，其特征在于，所述自体血清占所述完全培养液的体积比为1_15%。4.根据权利要求1所述的人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，其特征在于，所述步骤f中，所述ATG 浓度为50 ng/ml -1000ng/ml, CD16 单抗浓度为 2 μ g/ ml-100 μ g/ml ;IL_2浓度为200U/ml-1000U/ml;所述第二次添加新鲜IL-2，使IL-2的浓度为200 U/ml-1000U/ml ο5.一种如权利要求1-4任一所述的人自然杀伤细胞体外高效扩增方法中的因子组合应用，其特征在于，所述步骤f中，因子⑶16单抗，ATG和IL-2的组合应用。6.根据权利要求5所述的人自然杀伤细胞体外高效扩增方法中的因子组合应用，其特征在于，所述ATG的浓度为50 ng/ml -1000ng/ml, CD16单抗的浓度为2 μ g/ ml-100 μ g/ml ；IL-2 的浓度为 200U/ml-1000U/ml。
【专利摘要】本发明公开了一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括在处理好的培养体系加入CD16单抗，ATG,IL-2，37oC培养箱中孵育，计数，换液，添加新鲜IL-2；定期换培养液，继续培养适当时间得到人自然杀伤细胞。本发明的有益效果是：NK细胞在不进行磁珠分离,肿瘤修饰细胞刺激的情况下，应用ATG,CD16单抗短时间内得以高效扩增，极大程度上节约了生产成本且操作简便；NK细胞的扩增倍数达千倍以上，终比例达到80%-93%；生产效率较高，完全可以应用于大规模临床研究等；NK细胞的生长过程均在GMP条件下完成，保证无菌操作，并且在生产最后阶段进行各种安全检测，可应用于临床研究。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105462923
【申请号】CN201410776840
【发明人】郑成云, 郭亚男
【申请人】山东大学第二医院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年12月17日