leavase2 · 0(H〇logic，Madison，Wisconsin)。正向引物浓度是 500nM，反向引物浓度是500nM，活瓣探针是500nM，并且FRET盒于终浓度200nM使用。所有的 扩增和检测在LightCycler480光学热循环仪(Roche，Indianapolis，Indiana)上进行。
[0157] 包含KRAS基因（无论是野生型还是分别是三个突变体之一）的片段的质粒用于评 估实验系统检测掺入野生型拷贝中KRAS35A、T或C突变体拷贝的能力，在4种不同突变体水 平进行，包括1〇4突变体拷贝于1〇 5野生型拷贝（1:10)，1〇3突变体拷贝于1〇5野生型拷贝（1: 100)，10 2突变体拷贝于105野生型拷贝（1:1000)和10突变体拷贝于105野生型拷贝（1: 10000)。
[0158]图7显示扩增样品中突变体与野生型的不同比例的动力学扩增曲线数据和"交叉 点"（Cp;RocheLightCycler480手册，Indianapolis,IN)。在这些分析中，Cp作为焚光上升 至最大荧光的18%的点进行计算。在所检测的5个引物/侵入探针设计中，发现倒数第二位 错配，产生C:C错配，指定为KRAS35AP2C，显示在过量野生型序列存在时定量突变体的能 力最佳，显示对1:1 〇〇〇突变体/野生型的水平的剂量效应(图7)。
[0159] 本说明书还包括下列内容：
[0160] 1. 一种样品分析方法，其包括：
[0161] a)从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和 所述基因组座位的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于所述基因组座位的所述野生型拷贝 具有点突变；
[0162] 其中：
[0163] i .所述扩增使用第一引物和第二引物完成；以及
[0164] ii.所述第一引物包含与所述点突变碱基配对的3'末端核苷酸，还包含与所述基 因组座位中除了在所述3'末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的 核苷酸序列；
[0165] b)使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用：
[0166] i.侵入寡核苷酸，其具有与所述点突变碱基配对的3'末端核苷酸，和
[0167] ii.活瓣寡核苷酸，其包含与所述点突变碱基配对的核苷酸。
[0168] 2.实施方式1的方法，其中所述第一引物用作所述活瓣分析中所述侵入寡核苷酸。
[0169] 3.实施方式1或2的方法，其中所述样品含有的所述基因组座位的野生型拷贝为所 述基因组座位的突变体拷贝的至少100倍。
[0170] 4.实施方式1-3任一项的方法，进一步包括将所述扩增的样品中所述产物的量相 对于所述样品中存在的对照核酸的量进行标准化，从而确定所述样品中所述突变拷贝的 量。
[0171] 5.实施方式4的方法，其中所述对照核酸是不同于所述基因组座位的座位。
[0172] 6.实施方式4或5的方法，其中所述对照核酸使用活瓣分析检测，所述活瓣分析采 用具有于所述点突变位点与所述基因组座位的所述野生型拷贝碱基配对的3'末端核苷酸 的侵入寡核苷酸，从而检测所述样品中所述基因组座位的野生型拷贝的存在。
[0173] 7.实施方式4-6任一项的方法，其中所述活瓣分析采用第一活瓣分析试剂，所述第 一活瓣分析试剂包括第一侵入寡核苷酸、具有第一活瓣和第一FRET盒的第一活瓣探针，并 且其中所述对照核酸使用第二活瓣分析试剂来检测，所述第二活瓣分析试剂包括第二侵入 寡核苷酸、具有第二活瓣和产生可区分于所述第一FRET盒的信号的第二FRET盒的第二活瓣 探针，其中所述第一和第二活瓣试剂处于相同的反应混合物中。
[0174] 8.实施方式1-7任一项的方法，其中所述基因组座位的突变与癌症相关联。
[0175] 9.实施方式8的方法，其中所述基因组座位是KRAS基因。
[0176] 10.实施方式8的方法，其中所述基因组座位是BRAF基因。
[0177] 11.实施方式1 -10任一项的方法，其中所述样品获取自人。
[0178] 12.实施方式11的方法，其中所述样品是粪便。
[0179] 13.实施方式12的方法，还包括基于在所述粪便中所述基因组座位的突变体拷贝 是否被鉴定出来对结肠癌或腺瘤进行诊断。
[0180] 14.实施方式1-13任一项的方法，其中所述第一引物中所述错配是相对于所述末 端核苷酸位于位置-1、位置-2、位置_3、位置-4或位置-5。
[0181] 15.实施方式1-14任一项的方法，其中所述扩增和检测步骤使用含有PCR试剂和活 瓣试剂的反应混合物完成，并且在所述扩增和检测步骤之间没有向所述反应混合物中加入 额外的试剂。
[0182] 16.实施方式15的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩增和检测第二基 因组座位的PCR试剂和活瓣试剂。
[0183] 17.实施方式15的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩增和检测第二基 因组座位中点突变的PCR试剂和活瓣试剂。
[0184] 18. -种反应混合物，其包含：
[0185] a)扩增试剂，其包括热稳定的聚合酶、核苷酸、用于从核酸样品扩增靶基因组座位 的第一引物和第二引物;其中第一引物：
[0186] i.包含与所述基因组座位中点突变碱基配对的3'末端核苷酸；以及
[0187] ii.包含与所述基因组座位中除了所述3'末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错 配之外的序列完全互补的核苷酸序列；
[0188] b)活瓣分析试剂，其包括活瓣核酸内切酶、FRET盒、和包含与所述点突变碱基配对 的核苷酸的活瓣寡核苷酸；
[0189] c)所述核酸样品，其中所述核酸样品包含所述基因组座位的野生型拷贝和所述基 因组座位的突变体拷贝，所述基因组座位的突变体拷贝相对于基因组座位的所述野生型拷 贝具有点突变；
[0190] 其中所述反应混合物特征在于其能够扩增和检测所述样品中所述基因组座位的 所述突变体拷贝的存在。
[0191] 19.实施方式16的反应混合物，其中反应混合物任选地包含与所述第一引物不同 的、具有与所述点突变碱基配对的3 '末端核苷酸的侵入寡核苷酸。
[0192] 20.-种试剂盒，其包括：
[0193] a)PCR试剂，其包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含与基因组座位中 的点突变碱基配对的3'末端核苷酸，还包含与所述基因组座位中除了所述3'末端核苷酸6 个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；以及
[0194] b)活瓣分析试剂，其包括侵入寡核苷酸和活瓣寡核苷酸，所述侵入寡核苷酸具有 与所述点突变碱基配对的3'末端核苷酸，所述活瓣寡核苷酸包含与所述点突变碱基配对的 核苷酸。
[0195] 21.实施方式20的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于扩增和检测对照核酸 的PCR试剂和活瓣试剂。
[0196] 22.实施方式21的试剂盒，进一步包括用于进行实施方式1的方法的说明书。
【主权项】
1. 一种用于非诊断目的的样品分析方法，其包括： (a) 从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含KRAS的野生型拷贝和KRAS的突 变体拷贝，所述突变体拷贝相对于KRAS的所述野生型拷贝具有点突变;其中： (i) 所述扩增使用第一引物和第二引物完成；以及 (ii) 所述第一引物 包含与所述点突变碱基配对的3 '末端核苷酸，还 包含与KRAS中除了在所述3 '末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全 互补的核苷酸序列； (b) 使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用： (i)所述第一引物，和 (ii)活瓣寡核苷酸，其包含与所述点突变碱基配对的核苷酸。2. 权利要求1的方法，其中所述样品含有的KRAS的野生型拷贝为KRAS的突变体拷贝的 至少100倍。3. 权利要求1的方法，进一步包括 将所述扩增的样品中所述产物的量相对于所述样品中存在的对照核酸的量进行标准 化， 从而确定所述样品中所述突变拷贝的量。4. 权利要求3的方法，其中所述对照核酸是不同于KRAS的座位。5. 权利要求1的方法， 其中所述活瓣分析采用第一活瓣分析试剂，所述第一活瓣分析试剂包括所述具有第一 活瓣和第一FRET盒的第一活瓣探针，并且 其中所述对照核酸使用第二活瓣分析试剂来检测，所述第二活瓣分析试剂包括具有第 二活瓣和产生可区分于所述第一FRET盒的信号的第二FRET盒的第二活瓣探针， 其中所述第一和第二活瓣试剂处于相同的反应混合物中。6. 权利要求1的方法，其中所述样品获取自人。7. 权利要求6的方法，其中所述样品是自粪便提取的DNA。8. 权利要求1的方法，其中所述第一引物中所述错配是相对于所述末端核苷酸位于位 置-1、位置-2、位置-3、位置-4或位置-5。9. 权利要求1的方法，其中 所述扩增和检测步骤使用含有PCR试剂和活瓣试剂的反应混合物完成，并且 在所述扩增和检测步骤之间没有向所述反应混合物中加入额外的试剂。10. 权利要求1的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩增和检测第二基因组座 位的PCR试剂和活瓣试剂。11. 权利要求10的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩增和检测第二基因组 座位中点突变的PCR试剂和活瓣试剂。12. -种反应混合物，其包含： (a)扩增试剂，其包括热稳定的聚合酶、核苷酸、用于从核酸样品扩增靶KRAS的第一引 物和第二引物;其中第一引物包含： (i)与KRAS中点突变碱基配对的3 '末端核苷酸；以及 (ii)与KRAS中除了在所述3'末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全 互补的核苷酸序列； (b) 活瓣分析试剂，其包括活瓣核酸内切酶、FRET盒、和包含与所述点突变碱基配对的 核苷酸的活瓣寡核苷酸； (c) 所述核酸样品，其中所述核酸样品包含KRAS的野生型拷贝和KRAS的突变体拷贝， KRAS的突变体拷贝相对于KRAS的所述野生型拷贝具有点突变； 其中所述反应混合物不包含与所述第一引物不同的侵入寡核苷酸，并且 其中所述反应混合物特征在于其能够扩增和检测所述样品中KRAS的所述突变体拷贝 的存在。13. 权利要求12的反应混合物，其中所述反应混合物还包含用于扩增和检测对照核酸 的扩增试剂和活瓣测定试剂。14. 权利要求12的反应混合物，其中所述KRAS是人KRAS。15. 权利要求12的反应混合物，其中所述样品获取自人。16.权利要求15的反应混合物，其中所述样品是自粪便提取的DNA。17. 权利要求12的反应混合物，其中所述第一引物中所述错配是相对于所述末端核苷 酸位于位置-1、位置-2、位置_3、位置-4或位置-5。18. -种试剂盒，其包括： (a)PCR试剂，其包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物 包含与KRAS中的点突变碱基配对的3 '末端核苷酸，还 包含与KRAS中除了在所述3 '末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全 互补的核苷酸序列；以及 (b) 活瓣分析试剂，其包括活瓣寡核苷酸，所述活瓣寡核苷酸包含与所述点突变碱基配 对的核苷酸， 其中所述活瓣测定试剂不包含与所述第一引物不同的侵入寡核苷酸。19. 权利要求18的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于扩增和检测对照核酸的PCR 试剂和活瓣试剂。20. 权利要求18的试剂盒，其进一步包括用于进行权利要求1的方法的说明书。21. 权利要求18的试剂盒，其中所述KRAS是人KRAS。22. 权利要求18的试剂盒，其中所述第一引物中所述错配是相对于所述末端核苷酸位 于位置-1、位置-2、位置_3、位置-4或位置-5。
【专利摘要】本发明提供一种样品分析方法。在某些实施方案中，所述方法包括：a)扩增来自包括基因组座位的野生型拷贝和与基因组座位的所述野生型相关的一个点突变的基因组座位突变体拷贝的样品的产物，以生成扩增的样品，其中：i.扩增使用第一引物和第二引物完成；并且ii.第一引物包括与点突变碱基配对的3’末端核苷酸和还包括与基因组座位除了在3’末端核苷酸6个碱基内有一个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；和b)使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本发明还提供进行所述方法的试剂盒。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105463076
【申请号】CN201510893634
【发明人】邹鸿志, G·P·李德加德, M·J·多马尼科, H·阿拉维
【申请人】精密科学公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2011年11月2日
【公告号】CA2811104A1, CN103201394A, CN103201394B, EP2640856A1, EP2640856A4, US8715937, US9024006, US9121071, US9376721, US20120122106, US20140212878, US20140227697, US20140234836, WO2012067828A1