验证结果表明心血管事件组与对照组表4中的 4 个microRNA(miR-30c-5p、miR-16-2-3p、miR-98-5p和miR-3158-5p)表达量有差异，其它 microRNA的表达量没有显著差异。
[0076]当microRNA在心血管事件组的表达量为对照组的表达量的1倍以上时，表明该microRNA为风险预测microRNA，可作为评价阿司匹林疗效的生物学指标。
[0077] 表4、心血管事件组与对照组的测序基因筛选结果
[0080] 注：表4中，UP表示心血管事件组表达上调，DOWN表示心血管事件组表达下调； "FOLD"列中各数值表示二代测序结果筛查心血管事件组与对照组间microRNA表达变化倍 数。
[0081] 实施例3、用于预测阿司匹林对心脑血管疾病患者临床疗效的microRNA标记物的 验证
[0082] 按照实施例1中的血小板聚集率检测方法，对310例用于microRNA筛选后的焚光定 量PCR验证研究的入选患者进行分组，其中HAPR组共74例患者，No-HAPR组共236例患者。 [0083] 对310例用于microRNA筛选后的荧光定量PCR验证研究的入选患者进行全血 microRNA提取，将所提取的全血microRNA进行逆转录，置于-20°C保存;使用SYBRGreen荧 光定量PCR方法对表2中的10个microRNA进行扩增，定量分析HAPR组和No-HAPR组中这10个 microRNA的相对于U6的相对表达量(表5)，方法同实施例2,评估这10个microRNA与阿司匹 林临床疗效的相关性。
[0084] 表5、10个111丨(^〇1?熟在册?与如-即1?两组中的相对表达量
[0086] 用SPSS 16.0软件以No-HAPR组为对照，将两组患者的4个表达有差异的microRNA (miR-30c-5p、miR-16-2-3p、miR-98-5p和miR-3158-5p)和心血管事件发生危险因素进行 C0X回归分析(表6)<X0X回归结果表明miR-30c-5p、miR-3158-5p和吸烟因素与冠心病患者 规律服用阿司匹林仍然发生心血管事件发生风险显著相关。
[0087]表6、C0X回归分析心血管事件发生危险因素与microRNA发生风险
[0088]
[0089]R0C曲线分析了miR-30c-5p对于评价阿司匹反应性的预测价值（图l)，miR-30c-5p 的曲线下面积为0.720，灵敏度为54.84%，特异度为82.25%，miR-30c-5p的曲线下面积在 0.7-0.9之间，对阿司匹林临床疗效的评价有诊断价值。1?0(：曲线分析了1^1?-3158-5?对于评 价阿司匹反应性的预测价值（图2)，miR-3158-5p的曲线下面积为0.726，灵敏度为83.87 %， 特异度为51.52%，miR-3158-5p的曲线下面积在0.7-0.9之间，对阿司匹林临床疗效的评价 有诊断价值。11^1?-16-2-3?的曲线下面积为0.668，1^1?-98-5?的曲线下面积为0.596，1^1?-16-2-3p和miR-98-5p的曲线下面积均〈0.7，表明这两个microRNA对阿司匹林临床疗效的诊 断价值较低。
[0090] 根据两组患者miR-30c-5p的相对表达量判定为血小板高反应性(HAPR)患者miR-30c-5p相对表达量Ct值(范围-15.23~21.67)为非血小板高反应性0〇-!^?1〇患者相对表 达量Ct值(范围-13.89~19.28)的3-5倍(本发明中为5.613倍）。具体的，当以满足实施例1 中的心血管高危患者入选标准的患者作为检测对象时，根据上述结果，得到检测结果判定 标准如下：当以满足实施例1中的心血管高危患者入选标准的患者作为检测对象时，如果检 测对象的静脉血中miR-30c-5p的相对表达量在范围（-15.23~21.67)内且为No-HAPR心血 管高危患者的3-5倍(本发明中为5.613倍)以上，该检测对象为阿司匹林治疗下血小板高反 应性(HAPR)患者，如果检测对象的静脉血中miR-30c-5p的相对表达量不足No-HAPR心血管 高危患者的3-5倍(本发明中为5.613倍），该检测对象为非阿司匹林治疗下血小板高反应性 (No-HAPR)患者。
[0091] 根据两组患者miR-3158-5p的相对表达量判定为血小板高反应性(HAPR)患者miR-3158-5p相对表达量Ct值(范围-16.46~26.93)为非血小板高反应性(No-HAPR)患者相对表 达量Ct值(范围-19.14~29.42)的0.3-0.047倍(本发明中为0.047倍）。具体的，当以满足实 施例1中的心血管高危患者入选标准的患者作为检测对象时，根据上述结果，得到检测结果 判定标准如下：当以满足实施例1中的心血管高危患者入选标准的患者作为检测对象时，如 果检测对象的静脉血中11^1?-3158-5?的相对表达量在范围（-16.46~26.93)内且不足如-HAPR心血管高危患者的0.3-0.047倍(本发明中为0.047倍），该检测对象为阿司匹林治疗下 血小板高反应性(HAPR)患者，如果检测对象的静脉血中miR-3158-5p的相对表达量为No-HAPR心血管高危患者的0.3-0.047倍(本发明中为0.047倍）以上，该检测对象为非阿司匹林 治疗下血小板高反应性(No-HAPR)患者。
[0092] 本研究将心血管事件组与对照组比对发现miR-30c-5p和miR-3158-5p可构成阿司 匹林临床疗效的诊断系统，同时这两个microRNA可作为生物学标志物用于评估阿司匹林反 应性。
【主权项】
1.检测miR-3〇C-5p表达量的系统在制备预测或辅助预测阿司匹林对心血管疾病患者 疗效产品中的应用。2.检测miR-30c-5p表达量的系统在预测或辅助预测阿司匹林对心血管疾病患者疗效 中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述检测miR-30c-5p表达量的系统为 利用定量PCR检测miR-30c-5p表达量的系统。4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述检测miR-30c-5p表达量的系 统包括核苷酸序列为序列1的引物。5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于:所述miR-30c-5p表达量为外周血 中miR-30c_5p的表达量。6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于:所述系统包括microRNA数据处理 系统，所述microRNA数据处理系统用于计算将来自待预测阿司匹林治疗的心血管疾病患者 的miR-30c-5p的表达量，根据所述miR-30c-5p的表达量预测阿司匹林治疗对所述待预测心 血管疾病患者的疗效。7.以miR-30c-5p作为标志物的预测或辅助预测阿司匹林对心血管疾病患者疗效的系 统在制备预测或辅助预测阿司匹林对心血管疾病患者疗效产品中的应用。8. 预测或辅助预测阿司匹林对心血管疾病患者疗效的产品，为权利要求1-6中任一所 述检测miR-30c-5p表达量的系统。9.预测阿司匹林对心血管疾病患者疗效的方法，包括:检测来自待预测心血管疾病患 者的miR-30c-5p表达量；如果所述心血管疾病患者的静脉血中miR-30c-5p的表达量越高， 所述心血管疾病患者为或候选为阿司匹林治疗下血小板高反应性(HAPR)患者的风险越大， 如果检测对象的静脉血中miR-30c-5p的表达量越低，所述心血管疾病患者为或候选为阿司 匹林治疗下血小板高反应性(HAPR)患者的风险越小。10. 根据权利要求1-7中任一所述的应用或权利要求8所述的产品或权利要求9所述的 方法，其特征在于:所述心血管疾病患者为具有以下至少一种心血管疾病危险因素的患者： 患有稳定性心绞痛、急性冠脉综合征、经皮冠状动脉介入治疗手术、冠状动脉搭桥手术和缺 血性脑血管。
【专利摘要】本发明公开了检测miR-30c-5p表达量的系统在预测阿司匹林对心血管疾病患者疗效中的应用。本发明中，以非血小板高反应性患者为对照，对血小板高反应性患者的miR-30c-5p进行ROC曲线分析，曲线下面积为0.720，灵敏度为54.84％，特异度为82.25％。表明，检测对象的静脉血中miR-30c-5p的表达量可用于判断心血管疾病患者的阿司匹林临床疗效。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105463092
【申请号】CN201510989205
【发明人】刘梅林, 刘滕飞, 张婧薇, 冯雪茹, 陈夏欢
【申请人】北京大学第一医院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月24日