类，利用酵母 粉补充细胞生长所需少量精氨及亚精氨等胺类，能减少SAM损耗，对细胞积累SAM有促进作 用。
[0018]由于采用本发明的技术方案，本发明取得的优点和有益效果是:本发明能够适用 于各种酿酒酵母菌株;本发明采用了标记回收技术，实现用少数抗性标记对工业菌株进行 多个基因进行操作，并从新的角度对该菌株进行了代谢途径的改造，结果表明，糖原途径和 SAM脱羧途径缺失突变菌株的腺苷蛋氨酸产量达到了 9.98g/L，比原始菌株提高了 44.7%，从 而可以提高SAM的工业生产效率。另外，本发明采用了孢子分离技术来得到纯合的二倍体敲 除菌株，可以避免先单倍体分开敲除再融合的繁琐过程，提高了二倍体的敲除效率，且其为 酿酒酵母工业菌株，其本身具有的强腺苷蛋氨酸积累能力、优良的发酵特性以及食品安全 的生物性能，都是其它微生物不能比拟的，具有更好的技术效果。
【附图说明】
[0019]图1为PCR验证的核酸凝胶电泳图。Target gene即为目标基，A、B、C、D表示所用引 物，W表示野生型（本实例即为HD)，Δ表示突变型(本实例即为HD-GS);本电泳图表明HD-GS 中GLC3基因和SPE2基因均被敲除，且去除了标记。
[0020] 图2为10L发酵罐中，HD与HD-spe2的发酵生产SAM数据图。SAM Concentration即为 SAM浓度，Time为时间，在腺苷蛋氨酸粉末第一次加入时刻开始计时。
[0021] 图3为10L发酵罐中，HD-GS的生产SAM发酵数据图。Concentration即为SAM浓度， Glucose feeding rate即为葡萄糖流加速率，DCW即为细胞干重，Time即为时间。
【具体实施方式】
[0022]实施例一：以双倍体酿酒酵母菌株HD为例，构建SPE2基因敲除的纯合子并与HD比 较SAM产量。
[0023] 1、PCR构建敲除框。方法如下：以质粒pUG6为模版，用引物对SPE2-up和SPE2-down 进行PCR反应，PCR产物利用DNA纯化试剂盒纯化回收，经过DNA电泳确认，最终作为SPE2基因 敲除用的敲除框。
[0024] 2、LiAC转化。方法如下：挑原始菌株HD单菌落置于20mL YPD摇瓶中，转速200rpm， 30°C过夜培养，然后转接2mL到50mL YH)摇瓶中继续培养3-4个小时，0D6Q()大约为1的时候离 心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次，离心，去掉上清;再用0.1 M LiAC洗涤一次，离心，去 掉上清；用lmL 0.1M LiAC重悬菌体，转移到2mL离心管，再加入0.5mL 0.1M LiAC重悬菌体； 分装为每管50此，取两管，分别离心去上清，得到感受态细胞;按顺序加入240yL PEG、36yL 1 M LiAC、50yL ssDNA和34yL SPE2敲除框，然后混匀，放置室温15min，再进行42°C热激 20min;离心，去上清，再加入lmL YH)培养基，30°C预培养2h;离心，去上清，加入2mL无菌水 重悬，取50-100yL涂布到200yg/mL G418 YPD平板上，30°C培养36-48h。
[0025] 3、PCR验证。方法如下：在上述G418平板上挑菌落4-6个，进行PCR验证，DNA凝胶电 泳得到双条带的菌株即为敲除杂合子。
[0026] 4、将所得敲除杂合子涂布到麦氏产孢培养基（葡萄糖lg/L、KCl 1.8g/L、醋酸钠 8.2 g/L以及琼脂15 g/L)上培养3-4天，显微镜下确认孢子产率超过95%;收集少量孢子，加 入400yL蜗牛酶反应液(来自上海生工酵母基因组提取试剂盒），悬浮孢子，再加入10微升蜗 牛酶溶液，37°C下水浴3h;离心，用500yL无菌水重悬，再100W超声振荡处理5s，间歇7s，振荡 5个周期;最后，显微镜下确认孢子比较充分地分离(分离率大于80%)，用接种环取少量菌液 划线到200yg/mL的G418 YH)平板上，30°C下培养36-48h。挑取4-6个菌落，用引物对SPE2-A 和SPE2-D进行PCR验证。DNA凝胶电泳只得到一条含敲除框大小的条带的菌株即为敲除纯合 子，命名为HD-spe2。
[0027] 5、将的双倍体酿酒酵母菌株HD和spe2基因突变的HD-spe2菌株发酵生产SAM，方法 如下： (|)、将HD和HD-spe2分别接种到50mL YPD液体培养基，在200rpm、30°C恒温摇床培养18 小时后，分别转接到若干个50mL YH)摇瓶，每个摇瓶转接3mL，继续培养12小时，作为发酵罐 的种子液。
[0028] 10L发酵罐经过空消确定发酵罐性能良好以后，加入7L产SAM发酵培养基，115 °〇实消灭菌30min，然后冷却控温到30°C;产SAM发酵培养基成分如下：10g/L葡萄糖、3g/L 酵母粉、5g/L (NH4)2S〇4、l〇g/L KH2P〇4、3g/L MgS〇4、〇.lg/L MnS〇4?7H2〇、0.6 g/L ZnS〇4· 7H2〇、 0.55g/L FeS〇4、 〇.5g/L NaCl、0.5g/L CaCl2、1.6mg/L CuS〇4、4.84mg/L (NH4) 2Mo〇4、0.3mg/L 生物素、3.6mg/L 泛酸f丐、3.6mg/L 维生素 Bi、3.6mg/L 维生素 B6。
[0029] @、按照5%接种量将上述种子液分别接种到发酵罐中；整个过程中温度控制在30 °C，用氨水调节pH为5，调节搅拌速率控制溶氧在20%以上，调节流加速率控制葡萄糖浓度小 于5g/L;整个过程中每隔两小时取样测定一次，记录溶氧、pH、搅拌速率、0D6Q()、葡萄糖浓度 等，反应阶段分别保存菌液离心后的上清和菌体，用于测定乙醇浓度、细胞干重以及SAM产 量等;培养8-10个小时后，葡萄糖耗尽，开始流加葡萄糖和酵母粉混合液;继续培养22-24个 小时后，〇D_趋于稳定，分四次添加蛋氨酸粉末，每次20g;反应24个小时后，发酵结束。
[0030] ?、从上述保存菌体中萃取出SAM，并测定其含量：按每克湿菌体加入乙酸乙酯和 水各0.24mL，剧烈震荡处理30min;然后加入1.12mL 0.35M H2SO4，继续处理1.5h;萃取结束 后，离心收集上清，过滤后用于HPLC检测；HPLC检测条件为：安捷伦C18柱，检测波长为 256nm，流动相由40mM磷酸二氢铵、2mM庚烷磺酸钠、18%甲醇组成。HD和HD-spe2发酵过程 中生产SAM的比较如图2。
[0031] 实施例二:在模式菌株BY4741中进行SPE2基因的敲除，并验证其产量。
[0032] 方法如下： 1、PCR构建敲除框。方法如下：以质粒pUG6为模版，用引物对SPE2-up和SPE2-down进行 PCR反应，PCR产物利用DNA纯化试剂盒纯化回收，经过DNA电泳确认，最终作为SPE2基因敲除 用的敲除框。
[0033] 2、LiAC转化及PCR验证。方法如下：挑原始菌株BY4741单菌落置于20mL YPD摇瓶 中，转速200rpm，30°C过夜培养，然后转接2mL到50mL YPD摇瓶中继续培养7-8个小时，OD600 大约为1的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次，离心，去掉上清;再用0.1 M LiAC洗 涤一次，离心，去掉上清；用lmL 0.1M LiAC重悬菌体，转移到2mL离心管，再加入0.5mL 0.1M LiAC重悬菌体;分装为每管50 yL，取两管，分别离心去上清，得到感受态细胞;按顺序加入 240yL PEG、36yL 1 M LiAC、50yL ssDNA和 34yL SPE2敲除框，然后混匀，放置室温30min， 再进行42°C热激90min;离心，去上清，再加入lmL YH)培养基，30°C预培养4h;离心，去上清， 加入2mL无菌水重悬，取50-100yL涂布到200yg/mL G418 YH)平板上，30