D 对 HD-GS 进行 PCR 最终验证。
[0048] 5、摇瓶发酵生产SAM。方法如下：挑BY4741-GS单菌落到50mL YH)培养基，200rpm， 30°C下培养24h;然后转接到50mL产SAM培养基，每瓶接种3mL，同样条件下培养24h;每瓶加 入L-蛋氨酸粉末0. lg，摇匀，继续培养24h，离心，收集菌体，测量菌体干重并萃取SAM，测量 其浓度。其中产SAM培养基组分包括：30g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L (NH4)2S〇4,、5g/L K2HP〇4，、10g/L KH2P〇4、0.1g/L MnS〇4.7H20、0.1g/L ZnS〇4.7H20、0.2g/L MgCl2、0.1g/L CaCl2和0.1g/L C6H5Na3〇7 · 2H20。
[0049] 6、BY47 41与BY47 41 -GS生产SAM能力的比较。如下表格
由上表可见，GLC3基因和SPE2基因都突变的菌株比其出发菌株BY4741的SAM生产能力 有提高，进一步说明了本发明公布的提高腺苷蛋氨酸的方法行之有效。
【主权项】
1. 酿酒酵母代谢工程改造提高s-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，对酿酒 酵母菌株腺苷蛋氨酸脱羧途径进行了基因敲除。2. 如权利要求1所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法， 其特征在于，所述对酿酒酵母菌株腺苷蛋氨酸脱羧途径的敲除是通过敲除酿酒酵母菌株染 色体上腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SPE2来实现的。3. 如权利要求1或2所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方 法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株，在酿酒酵母单倍体菌株中实 施所述敲除包括以下步骤： 步骤1:设计含有SPE2基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯 化得到SPE2基因的敲除框； 步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中， 通过G418平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证。4. 如权利要求1或2所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方 法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，在酿酒酵母双倍体菌株中实 施所述敲除包括以下步骤： 步骤1:设计含有SPE2基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯 化得到SPE2基因的敲除框； 步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中， 通过G418平板筛选以及PCR验证，得到一条SPE2等位基因被置换的杂合子； 步骤3:将步骤2得到的杂合子置于产孢培养基上培养至孢子大量产生，收集孢子，溶解 孢子子囊壁后，分离孢子； 步骤4:将步骤3得到的分离孢子置于G418平板上培养至菌落生成，挑取单菌落进行PCR验证。5. 如权利要求3或4所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方 法，其特征在于，所述步骤中设计含有SPE2基因同源臂的引物，该引物序列为： 上游引物SPE2-up(5'-3'）： CATATAGTGTCTTACGCAAATAGGCGGACCATAGAATGACTGTCACCATACAGCTGAAGCTTCGTACGC 下游引物SPE2-down(5 ' -3 '）： ACAAGCGGGTTAAACTACATTAGTTATGAGTGCTAGAAAGCAAGCGAAGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG； PCR验证的引物序列为： 上游引物SPE2-A: 5 ' -CGCTCCTTGCATCAACTCTT-3 ' 下游引物SPE2-D: 5 ' -GCGGCTAAACTCCCTTAGCT-3 '。6. 酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其特征在于，在同一 酿酒酵母菌株中对糖原合成途径和腺苷蛋氨酸脱羧途径两个途径进行敲除。7. 如权利要求6所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法， 其特征在于在同一酿酒酵母菌株中将糖原支链酶基因GLC3和腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SPE2 两个基因进行敲除。8. 如权利7要求所述酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法，其 特征在于所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，以在酿酒酵母双倍体中先进行GLC3 敲除然后进行SPE2敲除，敲除采用以下步骤： 步骤1:以pUG6为模版PCR模版，构建GLC3敲除框，转化至酿酒酵母双倍体菌株中，经过G418平板筛选出一条GLC3等位基因被替换的杂合子； 步骤2:将步骤1得到的杂合子经过产孢培养基培养大量生成子囊孢子，所得子囊孢子 经过溶壁处理，得到分散孢子;分散孢子置于G418平板筛选，即可得到GLC3被敲除的纯合子 单菌落； 步骤3:将步骤2得到的GLC3被敲除的纯合子进行标记回收； 步骤4:在标记回收了的GLC3敲除纯合子上继续进行SPE2敲除和标记回收，最终得到GLC3和SPE2两个基因都敲除掉的纯合子。9. 如权利要求8所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法， 其特征在于权利要求8步骤3中将步骤2得到的进行标记回收，该步骤具体包含以下步骤： 步骤1:将PSH65质粒通过LiAC/PEG转化到GLC3被敲除的纯合子中，用博来霉素抗性进 行筛选； 步骤2:将步骤1所得到的博来霉素抗性菌株接种到YPG中，半乳糖存在条件下诱导菌株 合成Cre重组酶，从而导致染色体上G418抗性基因脱落； 步骤3:将步骤3所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到Yro和含有G418Yro平板的对应位置上，30°C下恒温培养两天； 步骤4:将YPD上生长而G418YPD上不生长的菌落挑出来，提基因组，进行PCR验证； 权利要求8步骤4中的标记回收具体包含以下步骤： 步骤1:将PSH65质粒通过LiAC/PEG转化到GLC3和SPE2被敲除的纯合子中，用博来霉素 抗性进行筛选； 步骤2:将步骤1所得到的博来霉素抗性菌株接种到YPG中，半乳糖存在条件下诱导菌株 合成Cre重组酶，从而导致染色体上G418抗性基因脱落； 步骤3:将步骤3所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到Yro和含有G418Yro平板的对应位置上，30°C下恒温培养两天； 步骤4:将YPD上生长而G418YPD上不生长的菌落挑出来，提基因组，进行PCR验证。10. 如权利6或7要求所述的酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的 方法，其特征在于，先进行GLC3敲除然后标记回收，再进行SPE2敲除和标记回收，得到GLC3 和SPE2都敲除的菌株，或者，先敲除SPE2基因后进行标记回收，再敲除GLC3基因后进行标记 回收，得到的GLC3和SPE2都敲除的菌株，对提高酿酒酵母菌株生产腺苷蛋氨酸产量都有效。
【专利摘要】本发明公开了一种酿酒酵母代谢工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生产水平的方法：利用酵母基因敲除技术，将酿酒酵母染色体上编码腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SPE2突变失活，得到SPE2突变菌株。与原始的酿酒酵母菌株相比，突变菌株积累SAM能力增强、生产SAM产量明显提高。特别是，在先敲除糖原支链酶基因GLC3得到酿酒酵母突变株基础上，进一步敲除再进行SPE2敲除，或者先敲除SPE2基因再敲除GLC3基因，对提高酿酒酵母菌株生产腺苷蛋氨酸产量有更明显的提高，可到达55.1%以上。
【IPC分类】C12R1/865, C12N1/19, C12P19/40, C12N15/81
【公开号】CN105483153
【申请号】CN201510691925
【发明人】徐志南, 赵伟军, 杨修亮, 杭宝建, 黄磊, 李江涛, 蔡谨
【申请人】山东金城生物药业有限公司, 浙江大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年10月23日